脂肪源性干細胞對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 ADSCs通過抑制腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)改善UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化
　　目的：
　　探討ADSCs對UUO大鼠腎小管上皮細胞EMT和間質(zhì)纖維化的影響及其可能的機制。
　　方法：
　　體外分離培養(yǎng)鑒定大鼠脂肪來源的ADSCs并用綠色熒光蛋白(GFP)進行體外標(biāo)記。45只雄性Wistar大鼠，分為3組，各15只:(1)單側(cè)輸尿管梗阻組，稱UUO組。大鼠行左

2、側(cè)輸尿管結(jié)扎，術(shù)后7天尾靜脈注射生理鹽水1ml;(2)單側(cè)輸尿管梗阻+細胞移植組，稱UUO+ADSCs組，大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，術(shù)后7d尾靜脈注射5×106ADSCs;(3)正常對照組，稱Sham組，手術(shù)入路方式同UUO組，進入腹腔后分離左輸尿管但不結(jié)扎輸尿管，術(shù)后7d尾靜脈注射生理鹽水1ml。為了示蹤干細胞移植后在腎臟內(nèi)的分布，另有8只UUO大鼠于手術(shù)后當(dāng)天經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染GFP的ADSCs。術(shù)后第14天處死動物留取血和腎組織標(biāo)本。

3、應(yīng)用自動分析儀測定血肌配和尿素氮水平。HE、Masson染色評估腎間質(zhì)纖維化程度。用免疫組化法測定腎組織中α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，成纖維細胞特異蛋白1(FSP-1)，纖連蛋白(FN)和E鈣粘蛋白(E-cadherin)水平表達變化。應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR和Western blot法分別檢測腎組織中α-SMA、FSP-1、FN和E-cadherin的基因水平和蛋白水平的表達。
　　結(jié)果：
　　1.ADSCs形態(tài)學(xué)

4、觀察與鑒定顯示大鼠脂肪來源的ADSCs具有典型的成纖維細胞形態(tài)，貼壁生長，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境下可向脂肪細胞和成骨細胞分化，表達CD29，CD90，CD44，不表達CD34，CD45，CD11b。
　　2.ADSCs腎臟內(nèi)示蹤顯示ADSCsGFP移植后24h，在腎小球及附近的血管可以觀察到少量的ADSCsGFP，但在移植后8周，僅在腎小球中發(fā)現(xiàn)極少的ADSCsGFP細胞。
　　3.手術(shù)后第14天，S ham組、UUO組與UUO+

5、ADSCs組血肌酐、尿素氮無顯著差異(p＞0.05)。
　　4.HE、Masson染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎臟組織學(xué)正常，UUO組大鼠可見嚴(yán)重腎間質(zhì)纖維化，包括腎小管擴張、萎縮以及小管上皮細胞空泡變性，腎間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤。經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO組腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕(p＜0.05)。
　　5.免疫組化結(jié)果顯示，UUO組α-SMA、FSP-1和FN表達較Sham組明顯增加，E-cadher

6、in表達較Sham組明顯減少(p＜0.05);經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO組α-SMA、FSP-1和FN表達明顯減少，E-cadherin表達明顯增加(p＜0.05)。
　　6.實時熒光定量RT-PCR和Western blot顯示，UUO組α-SMA、FSP-1和FN表達較Sham組明顯增加，E-cadherin表達較Sham組明顯減少(p＜0.05);經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO組α-S

7、MA、FSP-1和FN表達明顯減少，E-cadherin表達明顯增加(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　ADSCs可以減輕單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠早期腎間質(zhì)纖維化程度和腎小管上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，該作用可能與ADSCs下調(diào)腎間質(zhì)α-SMA、FSP-1和FN表達，上調(diào)E-cadherin表達有關(guān)。
　　第二部分 ADSCs通過抑制炎癥反應(yīng)改善UU0大鼠腎間質(zhì)纖維化
　　目的：
　　觀察ADSCs對UUO大鼠間質(zhì)

8、炎癥反應(yīng)的影響，探討ADSCs延緩腎間質(zhì)纖維化進展的機制。
　　方法：
　　實驗分組及組織標(biāo)本收集同第一部分。采用免疫組化法測定腎組織中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），Toll樣受體4(TLR4)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素-1β（IL-1β）和白介素-6(IL-6)的表達。實時熒光定量RT-PCR檢測MCP-1，TLR4，TNF-α，IL-1β和IL-6基因水平表達變化。
　　結(jié)果：
　　免疫組化

9、及實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，UUO組MCP-1，TLR4，TNF-α，IL-1β和IL-6表達較Sham組明顯增加(p＜0.05);經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO組MCP-1，TLR4，TNF-α，IL-1β和IL-6表達明顯減少(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　ADSCs可以減輕UUO大鼠早期腎間質(zhì)纖維化程度，該作用可能與ADSCs抑制UUO大鼠腎臟間質(zhì)炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　第三部分 ADS

10、Cs改善UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的分子機制
　　目的：
　　探討ADSCs是否可以通過抑制TGF-β1/Smad信號通路抗UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化
　　方法：
　　實驗分組及組織標(biāo)本收集同第一部分。采用免疫組化法檢測各組腎組織中TGF-β1蛋白表達。實時熒光定量RT-PCR檢測TGF-β1、Smad7基因水平的表達。Western blot方法檢測各組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、

11、p-Smad3和Smad7蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化結(jié)果顯示，UUO組TGF-β1表達較Sham組明顯增加(p＜0.05);經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO組TGF-β1表達明顯減少(p＜0.05)。
　　2.實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，UUO組TGF-β1表達較Sham組明顯增加，Smad7表達較Sham組明顯減少(p＜0.05);經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO

12、組TGF-β1表達明顯減少，Smad7表達明顯增加(p＜0.05)。
　　3.Western blot結(jié)果顯示，UUO組TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3表達較Sham組明顯增加，Smad7表達較Sham組明顯減少(p＜0.05);經(jīng)ADSCs治療后，UUO+ADSCs組較UUO組TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3表達明顯減少，Smad7表達明顯增加(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　ADSCs能通