大麥耐鎘及鎘積累相關(guān)QTL定位與候選基因篩選及調(diào)控研究.pdf

1、鎘是一種有毒重金屬，其在環(huán)境中的遷移性強(qiáng)，極易被植物吸收積累，并通過(guò)食物鏈危害人體健康。明確大麥耐鎘與鎘積累機(jī)理是培育耐鎘與低鎘積累新品種和制訂耐鎘與低鎘積累調(diào)控措施的基礎(chǔ)。本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的鎘耐性與鎘積累不同的大麥基因型為材料，探討鎘吸收和分布的規(guī)律及基因型差異的生理機(jī)理;分析不同籽粒鎘積累大麥基因型籽粒蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異，鑒定大麥籽粒低鎘積累相關(guān)的目標(biāo)蛋白;克隆籽粒鎘積累相關(guān)基因，并進(jìn)行大麥遺傳轉(zhuǎn)化;構(gòu)建大麥懸浮細(xì)胞系在細(xì)

2、胞水平上分析其耐鎘性差異及鎘積累目標(biāo)基因的表達(dá)情況;以耐鎘和鎘敏感基因型雜交產(chǎn)生F1構(gòu)建的DH群體為材料，構(gòu)建遺傳圖譜，進(jìn)行耐鎘相關(guān)性狀QTL定位及環(huán)境互作研究。同時(shí)，探討了外源乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對(duì)大麥鎘吸收與耐鎘性影響的基因型差異及生理機(jī)制，為低鎘積累育種與生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.鎘脅迫對(duì)大麥幼苗光合特性及鎘吸收與分布的影響及基因型差異
　　 以鎘

3、耐性與積累不同的大麥基因型（浙農(nóng)8號(hào)和W6nk2）為材料，水培試驗(yàn)，對(duì)照，5、50和500μM不同濃度鎘脅迫試驗(yàn)，研究了鎘脅迫對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)、光合特性及鎘吸收與分布的影響及基因型差異。結(jié)果表明，鎘脅迫顯著降低麥苗株高、根長(zhǎng)、葉綠素含量、地上部和根系干重;基因型之間差異顯著，耐鎘基因型浙農(nóng)8號(hào)受害較輕，鎘敏感基因型W6nk2抑制嚴(yán)重。根尖鎘熒光定位分析結(jié)果顯示，鎘主要滯留在根系的質(zhì)外體，尤其是細(xì)胞壁中，其中耐性基因型更為明顯;同一植株內(nèi)由

4、根尖到莖部的鎘含量呈逐漸下降趨勢(shì)，且處理時(shí)間越長(zhǎng)，鎘積累量越高，并有從根尖向莖部移動(dòng)的趨勢(shì)。鎘脅迫顯著影響大麥的光合作用及葉綠素?zé)晒?，且不同基因型之間差異顯著，鎘敏感基因型W6nk2受抑制嚴(yán)重，耐鎘基因型浙農(nóng)8號(hào)表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的抗性。
　　 2.不同籽粒鎘積累大麥基因型籽粒蛋白表達(dá)譜的比較研究
　　 利用雙向電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，分析比較了籽粒鎘積累不同的大麥基因型(浙農(nóng)8號(hào)和W6nk2)籽粒蛋白表達(dá)差異，檢

5、測(cè)到29個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，浙農(nóng)8號(hào)與W6nk2相比，籽粒蛋白質(zhì)高表達(dá)蛋白點(diǎn)17個(gè)，表達(dá)受抑制蛋白點(diǎn)12個(gè)。差異表達(dá)蛋白以蛋白酶抑制劑類相關(guān)蛋白為主，包括高表達(dá)蛋白α淀粉酶/胰島素抑制劑CM，Z-型絲氨酸蛋白酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑Z7;表達(dá)受抑制蛋白包括胰蛋白酶抑制劑蛋白BTI-CMe2.1蛋白、胰蛋白酶抑制劑蛋白BTI-CMe2.2蛋白和胰蛋白酶抑制劑。其次是熱休克蛋白HSP70和Ras致癌基因家族成員Rab4蛋白等脅迫相關(guān)蛋白

6、在浙農(nóng)8號(hào)中高表達(dá);而在W6nk2中有脫氫抗壞血酸還原酶等脅迫相關(guān)蛋白高表達(dá)。另外還有貯藏類蛋白，比如球蛋白，推定的燕麥蛋白前體在浙農(nóng)8號(hào)中高表達(dá)。這些差異表達(dá)蛋白可能與大麥籽粒鎘積累與耐性密切相關(guān)，本研究鑒定得到的蛋白可為深入闡明大麥鎘積累機(jī)理提供新的契機(jī)。
　　 3.大麥遺傳圖譜的構(gòu)建及苗期耐鎘相關(guān)性狀的QTL定位
　　 以萎縮不知（耐鎘）和蘇引麥2號(hào)（鎘敏感）雜交F1構(gòu)建的含有108個(gè)株系的大麥DH群體為材料，利用

7、SSR和SNP標(biāo)記，構(gòu)建遺傳圖譜，該圖譜包含41個(gè)SSR標(biāo)記和15個(gè)SNP標(biāo)記，圖譜總長(zhǎng)396.9 cM，標(biāo)記間平均距離8.1 cM。水培鎘脅迫試驗(yàn)，以不加鎘為對(duì)照，分析苗期耐鎘相關(guān)農(nóng)藝與生理性狀的耐鎘指數(shù)CTI，檢測(cè)到農(nóng)藝性狀相關(guān)加性QTLs9個(gè)，表型貢獻(xiàn)率介于3.30-9.49％之間;檢測(cè)到酶活和MDA含量相關(guān)QTL22個(gè)，分布在大麥7條染色體上，其加性效應(yīng)都達(dá)到了顯著水平。其中地上部和根系各有11個(gè)QTLs，平均表型變異為5.6％

8、。另外，檢測(cè)到一對(duì)控制根系GPX活性的上位性QTL。在第2染色體上標(biāo)記區(qū)間ABC2-Chitinase檢測(cè)到了4個(gè)QTLs，其中單株葉片數(shù)、根系CAT活性及根系干重都位于0.0cM處，推測(cè)為同一QTL，說(shuō)明控制這些性狀的基因很有可能與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)?；蚺c環(huán)境互作條件下，檢測(cè)到苗期鎘含量相關(guān)QTLs6個(gè);其中，地上部檢測(cè)到了2個(gè)，分別位于2H和7H上，且這2個(gè)QTLs存在極顯著地加性×加性上位性互作效應(yīng)，加性效應(yīng)值為-23.68，環(huán)

9、境鎘效應(yīng)引起的加性效應(yīng)值為-21.21，可解釋表型變異0.57％。根系檢測(cè)到4個(gè)，分別位于1H、5H、6H和7H上。地上部和根系分別檢測(cè)到7個(gè)和11個(gè)微量元素含量相關(guān)QTLs，總遺傳貢獻(xiàn)率分別為16.37％和24.95％，由于環(huán)境互作效應(yīng)引起的總遺傳變異分別為12.41％和14.6％。
　　 4.大麥不同生育期耐鎘及鎘積累相關(guān)性狀QTL定位
　　 盆栽試驗(yàn)，研究了鎘脅迫對(duì)不同生育期大麥生長(zhǎng)及生理性狀的影響及株系間差異，檢

10、測(cè)大麥不同生育期耐鎘與鎘積累相關(guān)QYLs。檢測(cè)到不同生育期鎘含量相關(guān)QTLs11個(gè)，檢測(cè)到2對(duì)上位性QTLs，分別控制籽粒鎘積累及根系Zn含量。另外，檢測(cè)到地上部鎘累積量相關(guān)的具有顯著加性與環(huán)境互作效應(yīng)的QTL1個(gè)。檢測(cè)到63個(gè)與微量元素含量相關(guān)QTLs，其中苗期、分蘗期、拔節(jié)期和灌漿期4個(gè)生育期葉片微量元素含量相關(guān)QTLs25個(gè)，收獲期不同器官微量元素相關(guān)QTLs38個(gè);其中17個(gè)具有顯著地加性與環(huán)境互作效應(yīng)。定位到了8個(gè)與農(nóng)藝和產(chǎn)量

11、CTI相關(guān)的QTLs，表型變異在1.54-10.79％之間。而且，遺傳標(biāo)記區(qū)間EBmac0615-EBmatc0054，EBmac0557-EBmac0615和SNP標(biāo)記ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白檢測(cè)到了鎘及數(shù)個(gè)微量元素含量相關(guān)QTLs。
　　 5.大麥籽粒鎘積累相關(guān)基因表達(dá)分析、克隆及大麥轉(zhuǎn)化
　　 利用基因芯片技術(shù)，分析了籽粒鎘積累差異顯著的大麥基因型(高積累:浙農(nóng)8號(hào);低積累:W6nk2)幼苗在鎘脅迫下的基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示，

12、鎘脅迫顯著影響大麥轉(zhuǎn)錄水平，基因型間存在顯著差異;對(duì)2基因型鎘脅迫下差異表達(dá)基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)，5μMCd處理誘導(dǎo)低鎘積累基因型W6nk2的運(yùn)輸載體相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，如ZIP、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ATPase、以及Zn、Fe離子運(yùn)輸載體等基因上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明W6nk2籽粒鎘低積累特性可能與這些轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的上調(diào)表達(dá)相關(guān);熒光定量PCR驗(yàn)證這些候選基因，得到了一致的表達(dá)。進(jìn)一步利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了ZIP基因家族在大麥里發(fā)現(xiàn)的4個(gè)成員ZIP

13、3、ZIP5、ZIP7和ZIP8的基因沉默表達(dá)載體，陽(yáng)性克隆載體經(jīng)PCR驗(yàn)證、酶切和測(cè)序鑒定;為了進(jìn)一步研究ZIP家族不同成員之間及在不同大麥基因型間的表達(dá)差異和功能，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化此基因到品質(zhì)較好的模式轉(zhuǎn)化大麥Goldenpromise，以期進(jìn)一步研究ZIP基因?qū)Υ篼滄k轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的調(diào)控與影響。
　　 6.不同大麥基因型懸浮細(xì)胞系的建立及耐鎘性差異分析
　　 以籽粒鎘積累不同的大麥基因型(高積累:浙農(nóng)8號(hào);低積累:W

14、6nk2)，和耐鎘性不同的大麥基因型(耐鎘:萎縮不知;鎘敏感:東17)為材料，在成功建立分散均勻、穩(wěn)定的胚性懸浮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，分析鎘脅迫對(duì)大麥懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響及其基因型差異，及鎘脅迫對(duì)不同基因型大麥懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響;并進(jìn)一步利用大麥不同基因型單細(xì)胞懸浮系來(lái)驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)前期結(jié)果所得基因ZIP蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，以直徑約2mm的幼胚為外植體，可以成功建立上述4基因型大麥懸浮細(xì)胞系;50μM Cd處理，4基因型大麥懸浮細(xì)胞活力都顯著

15、下降，隨著Cd處理時(shí)間延長(zhǎng)，大麥細(xì)胞活力逐步下降;且敏感基因型下降更為明顯。SDS-PAGE電泳和Western雜交結(jié)果表明，ZIP7蛋白在籽粒低鎘積累基因型W6nk2中的表達(dá)要強(qiáng)于浙農(nóng)8號(hào)，這一結(jié)果與前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。
　　 7.外源NAC對(duì)大麥鎘毒害的緩解效應(yīng)及基因型差異
　　 以耐鎘基因型萎縮不知和鎘敏感基因型東17為材料，水培試驗(yàn)，研究外源NAC對(duì)鎘所致大麥損傷的緩解作用。結(jié)果表明，50μM Cd處理下，添加20

16、0μM NAC(Cd+NAC)顯著減少大麥幼苗對(duì)鎘的吸收和積累;緩解大麥幼苗鎘毒害癥狀，2個(gè)基因型株高、根長(zhǎng)及生物量都比Cd處理顯著提高。外源NAC顯著影響細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及活性氧代謝，NAC顯著緩解鎘脅迫引起的葉綠體和根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，基本恢復(fù)葉綠體片層結(jié)構(gòu)的損傷，嗜鋨粒數(shù)量顯著減少，有效提高了根系分生組織細(xì)胞核膜的穩(wěn)定性和完整性。外源NAC對(duì)鎘脅迫引起的大麥氧化損傷有明顯的緩解效應(yīng)，顯著提高抗氧化酶活性，減少葉片O2(-)和·OH、M