細胞周期蛋白依賴性激酶9對同種移植排斥的影響及分子機制研究.pdf

1、迄今為止，器官移植仍是挽救終末期臟器衰竭的最有效措施。器官移植包括同種移植、異種移植和自體移植（同系移植）三大類，其中同種異基因移植是臨床最常見的移植類型。移植排斥反應是由多種基因相互作用引起的復雜病理生理過程，是造成移植物損傷并最終導致治療失敗的最重要因素。近年來免疫抑制療法的成功實施已使移植物短期存活方面得到明顯改善，然而移植物長期存活和患者生存率方面并未獲得明顯進步。目前臨床上常用的免疫抑制劑既無法消除復雜基因調(diào)控引起的持續(xù)免疫損

2、傷，同時還顯著抑制患者免疫功能，降低移植受者的生存質(zhì)量，這是目前器官移植領域面臨的嚴重問題。因此，研究尋找可在炎癥起始階段有效干預控制、靶向多種移植排斥相關(guān)基因的靶分子，設計出更高效高選擇性的抑制移植排斥反應的制劑，對于進一步闡明移植排斥機制和改善臨床器官移植成功率具有重要理論和實際意義。
　　細胞周期蛋白依賴性激酶9(Cyclin-dependent kinase9，CDK9)是正性轉(zhuǎn)錄延長因子b(Positive transc

3、ription elongation factorb，P-TEFb)的催化激酶，通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ)的羧基末端和負性轉(zhuǎn)錄延長因子，使轉(zhuǎn)錄從起始部位開始延伸。CDK9磷酸化RNAPⅡ是細胞轉(zhuǎn)錄延伸過程中的關(guān)鍵限速環(huán)節(jié)。初始反應基因(Primary Response Genes，PRGs)是一組誘導細胞內(nèi)外信號，且其表達無需啟動蛋白質(zhì)合成的基因。在信號反應基因的轉(zhuǎn)錄鏈中，這些“第一反應”的信

4、號發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括神經(jīng)細胞的生存可塑性，心肌應激反應，葡萄糖代謝等多種復雜的的生物學過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CDK9可通過控制初始反應基因的轉(zhuǎn)錄，在炎癥發(fā)生發(fā)展中起中心調(diào)控作用。CDK9包括兩個亞型，CDK942和CDK955，兩個亞型在不同器官組織和細胞中的表達各有不同。例如有研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的增加，體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞CDK955分子亞型的表達量逐漸減少，CDK942分子亞型的表達量逐漸相應增多。
　　鑒于CDK9對炎

5、癥的中心調(diào)控作用，本論文對CDK9是否增強同種移植排斥反應及其分子調(diào)節(jié)機制進行系統(tǒng)的深入研究，目的是闡明CDK9抑制劑對同種移植物生存狀態(tài)的影響，并研究其作用機制、調(diào)控因素及其調(diào)控的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路，明確CDK9的兩個分子亞型在同種排斥反應中的差異表達，從而為研究靶向CDK9特異亞型誘導同種移植物耐受提供理論和實驗依據(jù)，為臨床器官移植排斥提供新的治療手段。
　　第一部分同種移植受體CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1表達與移植物

6、生存相關(guān)性研究
　　研究方法
　　1.同種排斥過程中移植物CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1的動態(tài)表達
　　1.1構(gòu)建小鼠同系和同種移植模型
　　無菌條件下，分別將BALB/c和C57BL/6小鼠全厚度皮片移植到BALB/c小鼠背部并進行包扎，此兩種模型分別作為同系移植組和同種移植組。同種移植組進一步分為PHA747691（CDK9抑制劑）給藥組和生理鹽水對照組:在移植術(shù)進行第-1、1、3、5、7、9、11日

7、向?qū)嶒灲M小鼠灌胃給藥PHA767491(3，10，30mg/kg);等體積生理鹽水為對照組。于移植術(shù)后第4、8、12和16天脫椎處死小鼠，每組至少3只，分離移植皮片和脾臟。
　　1.2移植物CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1的表達
　　取移植術(shù)后第4、8、12和16天的同系移植組和同種移植對照組的皮膚移植物，提取總RNA，利用RT-qPCR方法，檢測CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1在同種排斥過程中的表達及變化。

8、r>　　2.CDK9抑制劑對同種移植排斥受體脾CD4+T細胞差異表達基因的影響
　　在排斥高峰期處死同種移植對照組小鼠，用CD4+T細胞分離試劑盒分離純化脾CD4+T細胞，用3μM PHA767491或等量PBS處理細胞2h。從本實驗室前期建立的相同模型移植排斥相關(guān)基因SAGE文庫中選出一定數(shù)量的差異表達基因，用RT-qPCR方法檢測CDK9抑制后這些差異表達基因在受體小鼠排斥高峰期脾CD4+T細胞中的表達。
　　3.CDK

9、9抑制劑對同種移植物生存期的影響
　　小鼠同種皮片移植術(shù)后第7天，拆除包被物，逐日觀察記錄兩組模型小鼠移植物的生存狀況，以移植皮片90％壞死作為完全排斥。移植術(shù)后第12天處死小鼠，HE染色觀察移植物的病理變化，免疫組化染色檢測移植物CDK9的表達。
　　4.CDK9抑制劑對同種移植受體脾CD4+T細胞比例的影響
　　移植后第12天處死小鼠，流式細胞術(shù)分析CDK9抑制劑對同種移植受體排斥高峰期脾CD4+T細胞的影響。

10、r>　　5.CDK9抑制劑對同種移植受體皮膚移植物CD4+T細胞的影響
　　取移植術(shù)后第12天的同種移植受體小鼠的移植皮片，常規(guī)操作進行免疫組化染色，檢測抑制CDK9對排斥期受體皮膚移植物CD4+T細胞浸潤的影響。
　　研究結(jié)果
　　1.CDK9表達與同種排斥具有顯著正相關(guān)性:CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1在同種移植對照組中的表達顯著高于同系移植組。CDK9的表達水平在同種排斥高峰期達到最高，并隨著排斥反應的緩

11、解而降低;在同種排斥反應的發(fā)生發(fā)展中Cyclin T1與CDK9的表達趨勢一致。結(jié)果表明CDK9表達與同種排斥反應具有顯著正相關(guān)性。
　　2.CDK9調(diào)控CD4+T細胞同種排斥相關(guān)基因:CD4+T細胞是同種移植排斥反應發(fā)生與否的決定因素，本論文從本實驗室前期建立的CD4+T細胞介導的同種移植排斥基因SAGE文庫中選取相關(guān)差異表達基因，并檢測CDK9抑制對這些移植排斥相關(guān)基因的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，PHA767491處理組的STAT1

12、、JAk2、Socs5、RhoA、Ly6e、Med8和Med11的mRNA水平較對照組顯著降低，而Gna13和Fbxw4的mRNA水平較對照組明顯升高，表明CDK9上調(diào)CD4+T細胞介導的同種排斥反應相關(guān)基因，下調(diào)移植耐受基因。
　　3.CDK9抑制明顯延長同種移植物存活期:同系移植組未發(fā)生排斥;同種移植對照組的皮膚移植物較早出發(fā)生排斥。與同種對照組相比，PHA767491給藥組移植物排斥發(fā)生延后且進程較緩慢。對照組小鼠移植皮片在

13、過繼后第10-11天發(fā)生排斥，而PHA767491給藥組在第17-18天排斥(p＜0.05)。結(jié)果表明CDK9抑制劑顯著改善移植物生存狀態(tài)，延長其存活期。
　　4.移植物病理及免疫組化染色結(jié)果: HE染色切片顯示，對照組的移植皮片炎性反應明顯，有大量單核巨噬細胞浸潤;而在PHA767491給藥組，移植皮片組織的炎性反應較輕，單核巨噬細胞浸潤明顯減弱。免疫組化染色結(jié)果顯示，在PHA767491處理組，皮膚移植物處CDK9表達水平顯著

14、降低。結(jié)果提示CDK9表達水平與排斥嚴重程度正相關(guān)，CDK9抑制可明顯延長同種皮膚移植物生存期。
　　5.CDK9抑制可顯著降低同種移植受體CD4+T細胞比例:流式分析結(jié)果表明，同種移植組受體脾CD4+T細胞顯著高于同系移植組，而PHA767491可顯著抑制同種排斥反應引起的CD4+T細胞擴增。免疫組化染色結(jié)果表明，PHA767491體內(nèi)應用可顯著抑制同種皮膚移植物CD4+T細胞浸潤。結(jié)果進一步證實CDK9高表達促進同種移植排斥反

15、應。
　　第二部分 CDK9抑制劑對CD4+T細胞介導的同種移植排斥的影響及機制研究
　　研究方法
　　1.構(gòu)建CD4+T細胞過繼轉(zhuǎn)輸C57BL/6-SCID小鼠同種皮膚移植模型
　　無菌狀態(tài)下，將野生型C57BL/6小鼠全厚度皮片移植到SCID小鼠右側(cè)背部，并用創(chuàng)口貼和透明膠帶進行包扎固定，術(shù)后第7天拆包。移植術(shù)3周后，移植皮片愈合。分離純化野生型BALB/c小鼠脾CD4+T細胞，分別用PHA767491(3μ

16、M)和等體積PBS處理細胞6小時，然后分別通過腹腔注射過繼轉(zhuǎn)輸?shù)缴鲜鯟57BL/6-SCID同種移植受體小鼠體內(nèi)作為PHA767491處理組和對照組。
　　2.CDK9抑制劑對CD4+T細胞介導的同種皮片移植物生存的影響
　　過繼CD4+T細胞后，逐日觀察并記錄兩組小鼠移植皮片生存情況。過繼后第12天對移植皮片HE染色，顯微鏡下觀察其病理變化。
　　3.CDK9抑制劑對過繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細胞介導的同種排斥反應的影響

17、r>　　3.1 CDK9抑制劑對過繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細胞細胞因子譜的影響
　　CD4+T細胞過繼第12天，脫椎處死兩組小鼠，獲得小鼠移植皮片、移植同側(cè)腋窩引流淋巴結(jié)和脾。利用細胞因子蛋白芯片分別檢測皮膚移植物、腋窩引流淋巴結(jié)和脾CD4+T細胞中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和IL-22的水平。
　　3.2 CDK9抑制劑對過繼轉(zhuǎn)輸CD4+T細胞中同種Teff活化的影響
　　CD4+T細胞過繼后第7天，提取脾

18、同種反應性CD4+CD25-Teff，并提取野生型BALB/c小鼠Teff作為陰性對照，利用流式細胞術(shù)檢測細胞CD69、CD25和胞內(nèi)IL-2水平。
　　3.3 CDK9抑制劑體外處理對Teff增殖能力的影響
　　提取野生型BALB/c小鼠CD4+CD25-Teff，用PHA767491(3μM)和等量的PBS處理Teff2小時，之后加入抗CD3抗體(2μg/ml)和抗CD28抗體(1μg/ml)刺激細胞，利用CCK8法檢測

19、Teff增殖情況。
　　4.CDK9抑制劑對CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞的影響
　　4.1 CDK9抑制劑對同種移植受體Treg細胞亞群比例的影響
　　細胞過繼后第12天處死兩組小鼠，應用CD4、CD25、Foxp3流式抗體對小鼠脾細胞進行熒光染色，利用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞在CD4+細胞中的比例。
　　4.2 CDK9抑制劑體外處理對Treg細胞增殖能力的影響

20、
　　分離野生型BALB/c小鼠脾臟CD4+CD25+ Treg細胞。用PHA767491(3μM)或等量的PBS處理分離的Treg細胞2小時，之后加入抗CD3抗體(2μg/ml)和抗CD28抗體(1μg/ml)刺激細胞，利用CCK8法檢測Treg細胞增殖狀況。
　　4.3 CDK9抑制劑體外處理對Treg細胞免疫負調(diào)控功能的影響
　　分離純化野生型BALB/c小鼠脾臟CD4+CD25+ Treg和CD4+CD25-T

21、eff細胞。用PHA767491(3μM或5μM)或等量的PBS處理分離的Treg細胞2小時，之后與Teff細胞混合，并加入抗CD3抗體(2μg/ml)和抗CD28抗體(1μg/ml)刺激細胞，利用CCK8法檢測Treg對Teff的抑制。
　　研究結(jié)果
　　1.成功建立同種移植模型:移植術(shù)后3周，移植部位愈合，移植皮片生長良好，表明C57BL/6-SCID小鼠同種皮膚移植模型成功建立。對照組的移植物在細胞過繼后第12-15天

22、發(fā)生排斥，而PHA767491處理組在第23-27天排斥，表明CDK9抑制劑處理可明顯減弱CD4+T細胞介導的同種排斥反應，延長同種移植物生存期。
　　2.CDK9促進Th1極化:在同種皮膚移植物和脾臟CD4+T細胞中，PHA767491處理組IFN-γ水平較對照組顯著降低，而IL-4和IL-10的水平顯著升高。腋窩引流淋巴結(jié)未檢測到細胞因子水平改變。IL-17和IL-22均無顯著變化。結(jié)果提示CDK9通過促進Th1極化增強同種移

23、植排斥。
　　3.CDK9促進同種反應性Teff的活化和增殖:為探討CDK9是否在細胞活化階段促進同種排斥反應，本論文在細胞過繼后第7天（過繼轉(zhuǎn)輸?shù)腡細胞開始識別同種抗原）提取受體小鼠脾Teff，利用流式細胞術(shù)和CCK-8法檢測細胞活化和增殖情況。結(jié)果顯示，PHA767491處理組Teff的CD69、CD25和胞內(nèi)IL-2水平及增殖能力均明顯低于對照組。結(jié)果表明CDK9在同種反應性Teff活化和增殖過程中起促進作用。
　　4

24、.CDK9提高同種移植受體Treg細胞比例:PHA767491處理組小鼠Treg細胞亞群在脾CD4+T細胞中的比例顯著高于對照組。而兩組Treg的增殖能力無顯著區(qū)別，PHA767491處理對Treg的抑制能力也無顯著影響。結(jié)果提示PHA767491可通過抑制Teff的活化和增殖，相應提高同種移植受體Treg細胞比例。
　　第三部分 CDK942和CDK955亞型在同種移植排斥中作用機制的研究
　　研究方法
　　1.CD

25、K9兩個亞型在同種抗原刺激下的表達
　　用野生型C57BL/6小鼠的脾細胞制備的可溶性同種抗原對PHA767491(3μM)或PBS預處理2h的BALB/c小鼠CD4+T細胞進行梯度時間刺激，留取細胞培養(yǎng)上清液，備用。用Western blot檢測各時間點CDK942、CDK955、 RNA聚合酶Ⅱ和β-actin的表達。
　　2.CDK9兩亞型在同種抗原刺激下的轉(zhuǎn)位
　　分離上述細胞的細胞核蛋白和胞漿蛋白，用West

26、ern blot和ELISA檢測各時間點細胞核、胞漿和細胞培養(yǎng)上清液中的CDK942、 CDK955以及其伴侶蛋白Cyclin T1的表達。
　　3.CDK942的核質(zhì)轉(zhuǎn)位促進形成炎癥微環(huán)境
　　為探究CDK942的轉(zhuǎn)位對細胞外微環(huán)境所起作用，本文用ELISA檢測上述方法2中細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、 IL-1β和IL-6的水平。
　　4.CDK942活化STAT1/IFN-γ信號通路
　　4.1 CDK9活化

27、的移植排斥相關(guān)基因與STAT1相關(guān)
　　用CDK9 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞系，從CD4+T細胞介導的移植排斥基因SAGE文庫中選出多個基因，用實時定量PCR檢測CDK9 siRNA轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞系中相關(guān)基因水平，探討CDK9對移植排斥反應相關(guān)信號通路的作用。
　　4.2 PHA767491顯著抑制STAT1的活化
　　用可溶性同系抗原或同種抗原對IL-6單克隆抗體、IFN-γ單克隆抗體、PHA7

28、67491(3μM)或等量PBS預處理2h的野生型BALB/c小鼠脾細胞進行刺激，用磷酸化STAT1和磷酸化STAT3的流式抗體染色，用流式細胞術(shù)分析STAT1和STAT3的活化。
　　5.CDK9主要通過調(diào)控STAT1促進同種排斥反應
　　建立小鼠同種皮膚移植模型，移植術(shù)后12天處死小鼠并取移植皮片進行固定、石蠟包埋、切片、免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察皮膚移植物CDK9、STAT1、STAT3和STAT5的表達。

29、　　研究結(jié)果
　　1.CDK942是同種排斥的主要分子亞型:同種抗原刺激后15min開始，CDK942亞型的表達水平逐漸升高，而CDK955明顯降低，RNA聚合酶Ⅱ與CDK942亞型的表達趨勢基本一致。PHA767491處理顯著抑制這三者的表達，提示CDK942是應答同種抗原刺激、促進下游免疫反應的主要分子亞型。
　　2.CDK942轉(zhuǎn)位促進形成炎癥微環(huán)境:隨著同種抗原刺激，CDK942從細胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，并釋放到胞外，而C

30、DK955較穩(wěn)定地在核內(nèi)表達。Cyclin T1相應轉(zhuǎn)位，但其表達趨勢與CDK9兩個亞型均不一致。對照組細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、 IL-1β和IL-6水平顯著升高，表達趨勢與CDK942一致。PHA767491可顯著抑制CDK942的轉(zhuǎn)位以及上清液中促炎細胞因子的表達，提示CDK942的轉(zhuǎn)位可促進形成炎癥微環(huán)境。
　　3.CDK9抑制劑明顯降低STAT1相關(guān)基因表達:CDK9抑制組的CXCL9、CXCL10、CXCL11、GB

31、P4、STAT1、JAk2和Socs5的mRNA表達水平較對照組顯著降低，這些基因均與STAT1相關(guān)，涉及細胞增殖、細胞活化、細胞生長與維持和信號傳導;與上述基因相比，與STAT3相關(guān)的基因如C4a、CXCL12、Chl1和Socs3無顯著改變。
　　4.CDK9主要通過調(diào)控STAT1/IFN-γ信號通路影響同種排斥反應:同種抗原刺激下，STAT1的活化水平明顯高于STAT3，IFN-γ阻斷組STAT1和STAT3的活化均被顯著抑

32、制，但IL-6阻斷組僅STAT3的活化受抑制，而且PHA767491顯著抑制磷酸化STAT1和STAT3的表達。結(jié)果表明，與STAT3相比，STAT1在同種反應中發(fā)揮更重要的促炎作用;CDK9在此過程中可能主要通過活化STAT1/IFN-γ信號通路而促進同種排斥反應。
　　5.免疫組化染色結(jié)果:與對照組相比，PHA767491給藥組移植物CDK9和STAT1受到顯著抑制，STAT3的表達也相應降低。STAT5在同種排斥組和PHA7

33、67491處理組均低水平表達，兩組間無顯著差異，提示CDK9主要通過調(diào)控STAT1促進同種排斥反應。
　　全文結(jié)論
　　1.同種移植物CDK9及其伴侶蛋白Cyclin T1表達水平與移植物的損害程度密切正相關(guān)。CDK9抑制劑體內(nèi)應用可顯著延長同種移植物生存期。
　　2.CDK9抑制劑體內(nèi)應用可明顯提高同種移植受體CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例，顯著抑制Teff活化和增殖，而對Treg的增殖和免疫負調(diào)控功

34、能無明顯影響。
　　3.CDK942是應答同種抗原刺激、促進下游免疫應答的主要分子亞型，調(diào)控多種移植排斥相關(guān)基因，其轉(zhuǎn)位可促進形成炎癥微環(huán)境。CDK9主要通過活化STAT1/IFN-γ信號通路促進同種排斥反應。
　　全文創(chuàng)新點
　　1.首次研究CDK9在同種移植排斥反應中的作用，證實CDK9抑制劑PHA767491可明顯延長小鼠皮膚同種移植物生存期，誘導移植免疫耐受形成。研究結(jié)果為臨床器官移植排斥提供新的治療手段。