骨髓移植新策略-磁力誘導細胞靶向移植模型的建立與研究.pdf

1、目的：
　　1.建立eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植模型，觀察移植后骨髓腔內HSCs的空間分布和定位。
　　2.建立eGFP和mRFP雙熒光蛋白轉基因小鼠異基因骨髓移植模型，觀察移植后骨髓腔內HSCs的空間分布和定位。
　　3.在eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植模型中，探索Magic-TT是否可提高移植后細胞的歸巢率，縮短造血和免疫重建時間。
　　研究內容：
　　第一部分eGFP熒光蛋白轉基

2、因小鼠同基因骨髓移植后骨髓腔內HSCs的空間分布和定位
　　方法：(1)20只C57BL/6受者雌性普通小鼠，隨機分為實驗組和對照組，各10只，移植前腸道準備;(2)5只C57BL/6雄性eGFP熒光蛋白轉基因供者小鼠，脫臼后取雙側股骨，制備成骨髓懸浮液;(3)兩組小鼠經7Gy強度清髓性放療后，實驗組尾靜脈輸注0.1ml骨髓液，細胞數(shù)約(5×106)/只，對照組尾靜脈輸注0.1mlPBS;(4)移植后觀察兩組小鼠的一般情況、植入水

3、平、造血恢復和生存期等。在受鼠造血恢復的過程中，取股骨半固體脫鈣后，用共聚焦顯微鏡等觀察骨髓中供者綠熒光細胞的分布、形態(tài)和定位等。
　　結果：(1)實驗組小鼠的造血恢復為（19.87±1.81）天，外周血中RFP+比例為(92.67±6.65)％;(2)對照組移植后第5天開始有小鼠死亡，第11天全部死亡，中位生存期為7.5d，死亡原因為造血衰竭，死亡時外周血白細胞均＜0.5×109/L，病死率達100％;(3)受鼠股骨經半固體脫鈣

4、后，直接在共聚焦顯微鏡下可清晰的觀察到骨髓腔中供者綠熒光細胞的形態(tài)和空間分布。
　　小結：本部分實驗使用eGFP熒光蛋白轉基因小鼠成功構建了eGFP→普通小鼠的同基因骨髓移植模型。供者細胞自帶綠熒光，該模型有助于探索移植后供者細胞在受者體內的遷移和分布，同時結合本團隊自創(chuàng)的半固體脫鈣法，在緩慢脫鈣的過程中半固體成分輕微流動，作為支撐成分逐步替代股骨中的鈣質成分，原位保留了股骨中供者細胞的位置、形態(tài)和熒光，在共聚焦顯微鏡下可清晰地觀

5、察到移植后受鼠骨髓中供者細胞的分布、形態(tài)和地位，為探索移植后受鼠骨髓中供者細胞的分布、歸巢和尋找造血干細胞“龕”的位置提供了新的思路，具有應用價值。
　　第二部分eGFP和mRFP雙熒光蛋白轉基因小鼠異基因骨髓移植后骨髓腔內HSCs的空間分布和定位
　　方法：(1)20只C57BL/6雌性eGFP轉基因小鼠，隨機分為實驗組和對照組，各10只，移植前腸道準備;(2)5只FVB雄性mRFP熒光蛋白轉基因供者小鼠，脫臼后取雙側股骨

6、，制備成骨髓懸浮液;(3)兩組小鼠經7.5Gy強度清髓性放療后，實驗組尾靜脈輸注0.2ml骨髓液，細胞數(shù)約(5.0×106)/只，對照組尾靜脈輸注0.2ml PBS;(4)移植后觀察兩組受鼠的一般情況、植入水平、造血恢復、移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率和生存期。在受鼠造血恢復的過程中，取股骨半固體脫鈣，用共聚焦顯微鏡等觀察骨髓中紅綠細胞的分布、形態(tài)和相互作用關系。
　　結果：(1)實驗組小鼠的造血恢復為（20.00±3.07）

7、天，外周血中RFP+比例為(93.94±1.59)％;1個月內4/10只受鼠有aGVHD表現(xiàn);(2)對照組移植后第5天開始有小鼠死亡，第11天全部死亡，中位生存期為8.5d，死亡原因為造血衰竭，死亡時外周血白細胞均＜0.5×109/L，病死率達100％。(3)受鼠股骨經半固體脫鈣后，共聚焦顯微鏡下可見骨髓腔中mRFP+細胞主要位于骨小梁周圍且被大量的GFP+細胞所包繞，三維構建后可清楚地觀察到骨髓微環(huán)境中紅綠熒光細胞的相互作用。

8、　　小結：本部分實驗使用eGFP和mRFP熒光蛋白轉基因小鼠成功構建了mRFP→eGFP的雙熒光小鼠異基因骨髓移植模型，結合半固體脫鈣法可清晰的觀察到移植后骨髓中供者細胞的分布及供受者細胞間的相互關系，為臨床觀察移植后供者細胞的分布、歸巢等相關研究提供了基礎。
　　第三部分Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植中的研究
　　方法：(1)40只C57BL/6受者雌性普通小鼠，隨機分為4組，分別為A組:尾靜脈

9、+磁珠組、B組:尾靜脈+磁珠+小磁場組、C組:尾靜脈+磁珠+中磁場組、D組:尾靜脈+磁珠+大磁場組，各10只，移植前腸道準備;(2)5只C57BL/6雄性eGFP熒光蛋白轉基因供者小鼠，脫臼后取雙側股骨，制備成骨髓懸浮液;(3)骨髓懸浮液中先后加入Anti-Sca-1-FITC、Anti-FITC磁珠孵化，使骨髓細胞中HSCs盡可能多的被納米磁珠標記;(4)4組小鼠經7Gy強度清髓性放療后，均分別尾靜脈輸注0.1ml含納米磁珠的骨髓液，

10、細胞數(shù)約(5×106)/只;(5)4組小鼠在移植后分別在股骨處不加磁場、加上弱磁場、中磁場和強磁場，24h后去除磁場;(6)觀察4組小鼠的一般情況，監(jiān)測體重、血常規(guī)、嵌合率、生存期等。
　　結果：小鼠于照射后體重進行性下降，伴活動減少，1周后精神、活動逐漸恢復，磁場組的部分小鼠磁鐵脫落，部分小鼠因磁鐵夾閉過緊而導致下肢紅腫甚至骨折。(1)4組小鼠的生存情況分別為:A組對照組移植后d17死亡2只，余生存時間＞30d，存活率80％;B

11、組弱磁場組小鼠全部存活，生存時間＞30d，存活率100％;C組中磁場組移植后d15死亡1只，余生存時間＞30d，存活率90％;D組強磁場組移植后d11死亡1只，余生存時間＞30d，存活率90％。4組小鼠移植后的生存時間差異無統(tǒng)計學意義。(2)4組小鼠造血基本恢復時，外周血中RFP+比例分別為(91.35±9.81)％、(95.13±1.50)％、(94.23±0.86)％、(91.53±3.30)％，表明移植成功。(3)將4組小鼠移植后

12、的血常規(guī)進行比較:白細胞P=0.081＞0.05，無統(tǒng)計學差異;血紅蛋白P=0.328＞0.05，無統(tǒng)計學差異;血小板P=0.007＜0.05，有明顯統(tǒng)計學差異，進行組間的多重比較，A組與B組P=0.143＞0.05、A組與C組P為=0.624＞0.05，均無統(tǒng)計學意義，A組與D組P=0.026＜0.05，有明顯統(tǒng)計學差異，且D組平均血小板數(shù)高于A組，B組與C組P=0.010＜0.05，有明顯統(tǒng)計學差異，且B組平均血小板數(shù)高于C組，D組

13、與C組P=0.000＜0.05，有明顯統(tǒng)計學差異，且D組平均血小板數(shù)高于C組，B組與D組P=0.155＞0.05，無明顯統(tǒng)計學差異。
　　小結：本部分實驗在第一章eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植的基礎上，將供者小鼠的骨髓細胞磁化+受者小鼠的股骨部位加入不同梯度的磁場，探索在磁場的作用下對小鼠移植后造血恢復的影響。結果初步表明在本次實驗所使用的磁場強度范圍內，Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植中，對白

14、細胞和血紅蛋白的恢復無明顯影響，但隨著磁場強度的增大，當達到一定磁場強度后可以縮短移植后血小板的造血恢復時間，這對改善移植后機體的造血恢復有重要意義。
　　結論和展望：
　　通過以上三部分的實驗研究，分別成功建立了eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植模型、紅綠雙熒光蛋白轉基因小鼠異基因骨髓移植模型。在以上兩種模型的基礎上，結合自創(chuàng)的半固體脫鈣體系，清晰地觀察到移植后骨髓腔內紅綠熒光細胞的位置、形態(tài)及供受者細胞間的相互作用

15、關系。本實驗采用了熒光蛋白轉基因小鼠進行移植，供受者小鼠細胞自帶紅綠熒光便于觀察，該模型的建立對探索移植后供者細胞在受者小鼠體內的分布、遷移、滯留等相關研究提供了極大便利，具有重要意義。同時結合自創(chuàng)的半固體脫鈣體系，使直接觀察移植后小鼠骨髓腔內供受者細胞的位置、形態(tài)及相互作用關系更加清楚，為追蹤移植后HSCs的歸巢和探索移植后小鼠造血恢復過程中供受者細胞在骨髓微環(huán)境中的相互作用提供了更廣闊的思路，具有重大意義。
　　本實驗的第三部

16、分探索了Magic-TT在eGFP熒光蛋白轉基因小鼠同基因骨髓移植中，對移植后小鼠造血恢復的影響，初步證實了Magic-TT在本次實驗所使用的磁場強度范圍內對白細胞和血紅蛋白的恢復無明顯影響，但隨著磁場強度的增大，當達到一定磁場強度后可以縮短移植后血小板的造血恢復時間，其深入研究和進一步完善將會為臨床改善移植后患者血小板的恢復情況提供良好的方法，具有重要的臨床應用價值。
　　后期本課題的延續(xù)將考慮使用Magic-TT聯(lián)合骨髓腔內移