N-乙酰氨基葡萄糖基轉移酶V表達受阻導致內質網應激及其誘導細胞凋亡的研究.pdf

1、本實驗室采用GnT-V反義cDNA質粒轉染SMMC7721細胞的方法，獲得穩(wěn)定表達株ASGnT-V7721，并用基因芯片技術檢測其基因表達與SMMC7721細胞的差別，發(fā)現(xiàn)ASGnT-V7721細胞基因表達符合內質網應激的特征。而且，內質網應激標志性分子GRP78和XBP1及PERK的變化也證明了ASGnT-V7721細胞存在內質網應激。為了進一步證明GnT-V表達受阻特異性地誘導內質網應激，本論文采用RNAi技術，構建GnT-VsiR

2、NA表達質粒并轉染SMMC7721細胞，通過檢測轉染后細胞GnT-V的mRNA及蛋白質表達水平驗證該GnT-VsiRNA表達質粒對細胞GnT-V表達的抑制作用，并且通過HRP標記凝集素ConA和DSA對細胞總蛋白的染色驗證GnT-V表達抑制后其功能的變化。也就是說，GnT-VsiRNA表達質粒不但抑制了GnT-V的表達，而且阻礙了其功能。然后我們用RT-PCR及Westernblot分別檢測ASGnT-V7721細胞GRP78和XBP1

3、的mRNA及蛋白表達的變化，并檢驗了細胞中PERK的磷酸化狀況，發(fā)現(xiàn)GRP78的mRNA和蛋白質表達量升高；XBP1的mRNA發(fā)生剪接，蛋白分子量從33KD變?yōu)?4KD；PERK蛋白發(fā)生磷酸化。這些變化都符合內質網應激的特征。因此這部分的實驗結果為“GnT-V表達受阻誘導內質網應激”提供了有利的佐證。本室以前的研究發(fā)現(xiàn)，ASGnT-V7721細胞在全反式維甲酸(ATRA)的誘導下凋亡敏感性增強。而劇烈的內質網應激也可以導致細胞凋亡。為了