GPR126對間充質(zhì)干細胞成軟骨分化和成骨分化的影響及其作用機制研究.pdf

1、背景：
　　青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎對青少年的身心造成嚴重的影響，研究其病因，探索早期診斷和新型治療手段成為研究重點。GPR126在機體各個系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在近年的全基因組關(guān)聯(lián)分析中發(fā)現(xiàn)GPR126上的單核苷酸多態(tài)性與青少年特發(fā)性脊柱側(cè)彎具有相關(guān)性，且相同位點的多態(tài)性還與軀體長度相關(guān)，因此GPR126對骨骼系統(tǒng)發(fā)育的影響受到了研究者的關(guān)注。目前的研究發(fā)現(xiàn)GPR126參與軟骨發(fā)育的過程，并對骨形成也有影響。研究顯示GPR126

2、在其他系統(tǒng)的發(fā)育中具有影響細胞—細胞間接觸和電耦合的作用，而其結(jié)構(gòu)特點又使GPR126能與鄰近細胞、分子、細胞外基質(zhì)發(fā)生相互作用，甚至遠處細胞也可與GPR126被酶解的N端片段(NTF)發(fā)生相互作用，而間充質(zhì)干細胞聚集是體內(nèi)和體外成軟骨必須的起始階段，且對成骨也有一定的影響。因此GPR126對細胞間黏附或相互作用的影響可能是它調(diào)控間充質(zhì)干細胞成軟骨、成骨分化的機制。人臍帶間充質(zhì)干細胞具有一般間充質(zhì)干細胞貼壁生長、可多向分化的特點，且采集

3、過程無創(chuàng)傷、細胞活力佳、病毒感染率低、不易老化、多次傳代表型不易變化、獲取細胞量多等優(yōu)點，因此在近些年被認為是獲得間充質(zhì)干細胞的優(yōu)良來源。
　　目的：
　　此次研究通過慢病毒侵染構(gòu)建GPR126敲低的人臍帶間充質(zhì)干細胞株，并按照標準的流程進行成骨和成軟骨實驗，以茜素紅染色、阿爾新藍染色、熒光定量PCR、免疫組織化學、Western-blot觀察對照細胞和GPR126敲低細胞間成骨、成軟骨的差異，探索GPR126對間充質(zhì)干細胞

4、成軟骨、成骨影響的具體分子機制。
　　方法：
　　1、無菌條件下獲取近胎兒端10cm臍帶組織，去除臍帶動靜脈后將臍帶切成1mm3左右小塊進行貼壁培養(yǎng)。分離的細胞進行誘導成骨、成軟骨、成脂分化。
　　2、合成敲低shRNA序列，與慢病毒載體酶切連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌并送菌液測序。選取陽性菌液擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293FT細胞后獲得病毒上清，以病毒上清侵染人臍帶間充質(zhì)干細胞，流式分選后繼續(xù)培養(yǎng)，以熒光定量PCR和Weste

5、rn-blot檢測鑒定敲低效果。
　　3、將對照細胞和GPR126敲低細胞分別進行成軟骨、成骨誘導分化，阿爾新藍染色、免疫組織化學檢測CollagenⅡ和Aggrecan觀察成軟骨效果，茜素紅染色、Western-blot檢測堿性磷酸酶和骨鈣素觀察成骨效果。
　　4、熒光定量PCR檢測成軟骨團、成骨分化細胞中GPR126和黏附相關(guān)成員的mRNA表達變化，并以免疫組織化學和Western-blot檢測驗證蛋白表達水平的變化。<

6、br>　　結(jié)果：
　　1、本次實驗中獲得的長梭形細胞可貼壁生長、增殖能力強，符合一般的間充質(zhì)干細胞形態(tài)及培養(yǎng)特性，且分化實驗也證明其具有成骨、成軟骨、成脂分化潛能，可認為該細胞就是間充質(zhì)干細胞。
　　2、病毒侵染分選培養(yǎng)后，熒光率可達80％以上，熒光定量PCR顯示GPR126-shRNA1和GPR126-shRNA2細胞株的GPR126 mRNA表達水平顯著低于GPR126-CON細胞株;提取膜蛋白進行Western-blo

7、t檢測后發(fā)現(xiàn)GPR126-shRNA1和GPR126-shRNA2細胞株的GPR126蛋白表達水平顯著低于GPR126-CON細胞株。說明侵染的GPR126敲低病毒確實有敲低效果。
　　3、GPR126-CON細胞形成的軟骨團較疏松，而GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2形成的軟骨團較致密。CollagenⅡ和Aggrecan在GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2細胞分化的軟骨團中高表達。GPR

8、126-CON細胞分化為成骨細胞后，鈣結(jié)節(jié)紅染，均勻分布在視野中，而GPR126-shRNA1、GPR126-shRNA2細胞成骨在成骨分化過程中有互相聚集的趨勢，形成“小島”狀鈣結(jié)節(jié)集合，在更高倍顯微鏡下可觀察到鈣結(jié)節(jié)密集的情況。成骨分化過程中對照組堿性磷酸酶和骨鈣素表達水平高于敲低組。
　　4、對照組和敲低組間充質(zhì)干細胞在成軟骨過程中GPR126均有升高，對照組GPR126mRNA上調(diào)表達的程度顯著高于敲低細胞。L-選擇素mR

9、NA表達水平在對照組和敲低組細胞成軟骨、成骨分化過程中均升高，且對照組L-選擇素mRNA上調(diào)表達的程度高于敲低組。對照組細胞成軟骨、成骨分化后L-選擇素蛋白表達水平高于敲低組。
　　結(jié)論：
　　1、應用人臍帶組織貼壁法可分離得到間充質(zhì)干細胞，經(jīng)觀察細胞形態(tài)、培養(yǎng)特性以及細胞多向誘導分化實驗鑒定可明確為間充質(zhì)干細胞;
　　2、構(gòu)建的GPR126敲低慢病毒確實能降低GPR126的表達水平，得到2株GPR126敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)人臍