小膠質細胞激活對皮質神經元SOD活性和MDA含量的影響.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)是在特殊外力作用下發(fā)生的以神經元軸索腫脹、斷裂為主要特征的彌漫性腦損傷，可單獨出現(xiàn)也可伴隨其他病理改變，是導致顱腦損傷患者死亡、重殘和植物狀態(tài)生存的最常見原因之一。典型表現(xiàn)為意識障礙，且預后較差。研究表明，DAI后腦功能障礙不僅是由于最初的機械外力等作用所致的原發(fā)性損傷，很大程度上與損傷后發(fā)生的復雜的神經元“二次打擊”(神經元繼發(fā)性損傷)有關，其繼發(fā)性損傷是指損傷

2、后一系列生化和細胞反應導致的延遲性軸索斷裂。
　　前期實驗已經觀察到DAI后，在β-APP陽性表達的軸索周圍有大量的小膠質細胞被激活。已有研究表明，活化的小膠質細胞可出現(xiàn)“呼吸爆發(fā)現(xiàn)象”，產生數(shù)量驚人的自由基，引起脂質過氧化，還可引起細胞成分脂質、蛋白之間相互交聯(lián)，損傷神經元功能。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)作為存在于胞漿和線粒體中的一種金屬蛋白酶，其活性高低可間接反映組織自由基的含量和脂質過氧

3、化程度。丙二醛(malondialdehyde，MDA)作為細胞膜多不飽和脂肪酸受到活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)攻擊后發(fā)生脂質過氧化反應的終產物之一，其含量變化可間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度。因此，神經損傷的機制不僅限于直接的細胞因子作用，小膠質細胞激活后產生的毒性作用或許更為重要。然而在體外培養(yǎng)條件下小膠質細胞是否可通過介導氧化損傷途徑參與皮質神經元的遲發(fā)性進行性損傷尚未見報道。
　　

4、本實驗采用乳鼠大腦皮質原代培養(yǎng)，首先給予一定量Aβ1-40誘導激活小膠質細胞，再用其條件培養(yǎng)基刺激皮質神經元。通過SOD活性和MDA含量變化系統(tǒng)觀察小膠質細胞是否對皮質神經元造成氧化損傷，以此探討在體外實驗中活化的小膠質細胞與皮質神經元之間的相互作用。
　　方法：原代培養(yǎng)新生SD乳鼠(24h內)大腦皮質小膠質細胞。用不同濃度的可溶性Aβ1-40誘導激活小膠質細胞后，采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中TNFα和IL-1β的分泌量以確定小

5、膠質細胞最佳活化狀態(tài)。加入米諾環(huán)素后用Real Time PCR法和ELISA法檢測TNFα和IL-1β的表達變化，觀察其抑制小膠質細胞活化的作用。再用活化后的小膠質細胞條件培養(yǎng)基刺激原代培養(yǎng)的皮質神經元，隨機分為4組：對照組、1/2 Aβ-MCM組、1/4 Aβ-MCM組、1/8 Aβ-MCM組。每組包括5個時間點：1h、3h、6h、12h、24h。黃嘌呤氧化酶法測定各組皮質神經元超氧化物歧化酶(SOD)活力高低，硫代巴比妥酸法測定丙

6、二醛(MDA)含量變化，以此觀察神經元的氧化損傷程度。
　　數(shù)據用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(least significant difference，LSD)作兩兩比較。P＜0.05為有顯著性差異。
　　結果：
　　1、Aβ1-40對小膠質細胞的誘導激活及米諾環(huán)素的抑制作用：
　　ELISA法結果

7、顯示，1μMAβ1-40孵育6h能成功誘導激活小膠質細胞分泌TNFα、IL-1β，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.01)，并且這種誘導激活作用具有時間及濃度依賴性。加入0.2μM米諾環(huán)素后Real TimePCR法和ELISA法檢測結果均表明，米諾環(huán)素可明顯抑制小膠質細胞TNFα和IL-1β的分泌，MC+Aβ組與Aβ組相比明顯下降(p＜0.01)，與對照組相比無顯著性差異(p＞0.05)。因此我們選用終濃度為1μM的Aβ1-40孵育小

8、膠質細胞6 h后的培養(yǎng)上清作為最佳條件培養(yǎng)基刺激皮質神經元。
　　2、小膠質細胞條件培養(yǎng)基對皮質神經元的氧化應激損傷：
　　結果顯示，經不同濃度條件培養(yǎng)基刺激后，皮質神經元SOD活力值均低于對照組，以1/2 Aβ-MCM組最明顯，24h達到最低，與對照組相比，有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且有隨刺激時間延長及刺激因子含量增加而漸低的趨勢，而1/4 Aβ-MCM組和1/8 Aβ-MCM組各時間點皮質神經元SOD活力值與對