下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)-結(jié)節(jié)乳頭體核對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的調(diào)節(jié)作用及其受體途徑研究.pdf

1、目的:
　　下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)（ventrolateral preoptic nucleus，VLPO）和結(jié)節(jié)乳頭體核（tuberomammillary nucleus，TMN）分別是公認(rèn)的促睡眠中樞和促覺(jué)醒中樞，兩者以“此消彼長(zhǎng)”相互制約的模式進(jìn)行睡眠覺(jué)醒周期的調(diào)控。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是腦內(nèi)參與睡眠覺(jué)醒調(diào)節(jié)的重要神經(jīng)遞質(zhì)。為了進(jìn)一步探究和闡述下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)-結(jié)節(jié)乳頭體核調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒周期的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多導(dǎo)睡眠

2、描記技術(shù)、腦立體定位微量注射技術(shù)、免疫組織化學(xué)等方法探討VLPO-TMN對(duì)大鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響及其調(diào)節(jié)的受體通路。
　　方法:
　　1.動(dòng)物分組：根據(jù)實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計(jì)，大鼠用于三個(gè)部分：
　　1.1 多導(dǎo)睡眠描記與分析：大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組[VLPO和TMN內(nèi)均微量注射人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF），即VLPO+ACSF& TMN+ACSF組]和實(shí)驗(yàn)組Ⅰ（VLPO微量

3、注射 L-Glu同時(shí)TMN微量注射ACSF，即VLPO+L-Glu& TMN+ACSF組）、實(shí)驗(yàn)組Ⅱ（VLPO微量注射L-Glu同時(shí)TMN微量注射Bic，即VLPO+L-Glu& TMN+Bic組）。
　　1.2 檢測(cè)VLPO區(qū)域代謝型谷氨酸受體以及TMN核團(tuán)GABAA受體表達(dá)。
　　1.3 觀察興奮VLPO神經(jīng)元后TMN區(qū)域c-Fos表達(dá)量的變化：大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（VLPO微量注射ACSF，即VLPO+ACSF組）和實(shí)驗(yàn)

4、組（VLPO微量注射L-Glu，即VLPO+L-Glu組）。
　　2.動(dòng)物模型建立選取健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠，體重280-300g。手術(shù)前準(zhǔn)備好所需試劑以及儀器設(shè)備。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后將其頭部固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，根據(jù)大鼠腦定位圖譜把兩根不銹鋼中空引導(dǎo)管插入VLPO（AP：-0.36mm；R：1.30mm；H：-7.00mm）及TMN（AP：-3.96mm；R：1.50mm；H：-7.70

5、mm）用于核團(tuán)內(nèi)給藥，用牙科粘固粉將中空引導(dǎo)管和記錄電極固定于大鼠顱骨表面，再把引導(dǎo)腦電與肌電的電極用細(xì)銅線和微型插座相連接（上述操作步驟用于建立多導(dǎo)睡眠描記模型，觀察大鼠c-Fos表達(dá)變化的大鼠模型建立只需向VLPO內(nèi)插入一根不銹鋼中空引導(dǎo)管用于微量給藥，同時(shí)省去上述電極與微型插座的操作），然后給予大鼠一定劑量抗生素（青霉素），縫合創(chuàng)口，最后放入隔音室中飼養(yǎng)，保證飲水和食物充足，并隨時(shí)觀察大鼠恢復(fù)狀況。
　　3.微量注射給藥用H

6、amilton微量注射器通過(guò)中空引導(dǎo)管向目的核團(tuán)VLPO/TMN注射藥物或ACSF，注射速度為1?l/min，給藥完成將注射器停留1min防止藥液滲出。給藥時(shí)間為22:00-22:20（睡眠描記）和20:00-20:20（c-Fos表達(dá)量變化觀察）。
　　4.多導(dǎo)睡眠描記分析數(shù)據(jù)記錄從給藥前2小時(shí)（20:00）開(kāi)始，記錄時(shí)間為24小時(shí)。10秒為一個(gè)分段周期，將大鼠的睡眠覺(jué)醒周期分成：（1）覺(jué)醒期（wakefulness，W）；（2

7、）快動(dòng)眼睡眠期（rapid eye movement，REM）；（3）非快動(dòng)眼睡眠期（non-rapid eye movement，NREM）；REM睡眠和NREM睡眠總和定為總睡眠時(shí)間（total sleep time，TST）。
　　5.取材大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，剪開(kāi)胸腔并暴露心臟，持灌流針從心尖插入心臟經(jīng)左心室至主動(dòng)脈，迅速剪開(kāi)右心耳，快速注入生理鹽水約250ml，看到肝臟發(fā)白，再緩慢注入4％多聚甲醛約600ml，隨后斷頭并用止

8、血鉗小心撥開(kāi)顱骨取出腦組織。用刀片切成0.5cm左右厚度，最后放入4%多聚甲醛固定6h。
　　6.免疫組化檢測(cè)將包含目的核團(tuán)的蠟塊切成厚度為4um的切片，烤片后用二甲苯脫蠟梯度酒精水化，使用免疫組化試劑盒進(jìn)行受體染色，最后在顯微鏡下觀察染色情況。
　　7.半定量分析TMN區(qū)域的c-Fos染色用累計(jì)光密度（integrated optical density，IOD）值反映蛋白表達(dá)水平。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS1

9、7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（-x±s）表示，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）以及t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1. VLPO微量注射ACSF/L-Glu與TMN微量注射ACSF/Bic對(duì)大鼠腦電活動(dòng)的影響
　　1.1 與對(duì)照組VLPO+ACSF& TMN+ACSF組（n=8）相比，VLPO+L-Glu&TMN+ACSF組（n=7）大鼠VLP

10、O內(nèi)微量注射L-Glu后從第二個(gè)小時(shí)起的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)，其覺(jué)醒減少42.2%（38.13±3.17，P<0.01），非快動(dòng)眼睡眠（NREM）與總睡眠時(shí)間（TST）分別增加了89.5%（52.90±2.98，P<0.01）、80.5%（69.33±3.63，P<0.01），快動(dòng)眼睡眠（REM）無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　1.2 與VLPO+L-Glu& TMN+ACSF組（n=7）相比，VLPO+L-Glu& TMN+Bic組（

11、n=8）中GABA受體阻斷劑Bic和L-Glu分別相繼微量注射于TMN和VLPO，給藥后的第二、三個(gè)小時(shí)內(nèi)大鼠的覺(jué)醒量增加了81.1%（66.12±3.26，P<0.01），REM睡眠和NREM睡眠以及TST分別減少了58.9%（4.94±1.02,P<0.05）、50.2%（39.62±2.93,P<0.01）、56.1%（47.11±4.14,P<0.01）。
　　1.3 與VLPO+ACSF& TMN+ACSF組比較，VLP

12、O+L-Glu& TMN+Bic組的大鼠睡眠覺(jué)醒狀況未發(fā)生顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.免疫組化結(jié)果
　　2.1 mGluR5在 VLPO區(qū)域的表達(dá)與用PBS代替一抗的空白對(duì)照相比，mGluR5在VLPO區(qū)域陽(yáng)性表達(dá)明顯，呈現(xiàn)棕黃色的強(qiáng)染色，定位于胞質(zhì)膜，核呈藍(lán)色，細(xì)胞容易辨認(rèn)，結(jié)構(gòu)清晰，陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)良好。
　　2.2 GABAARβ1在 TMN區(qū)域的表達(dá)與用PBS代替一抗的空白對(duì)照相比，TMN區(qū)域的 GABA

13、ARβ1為棕色或棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，定位于細(xì)胞膜，核呈藍(lán)色，細(xì)胞容易辨認(rèn)，結(jié)構(gòu)清晰，陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)良好。
　　3.激動(dòng)VLPO后TMN區(qū)域c-Fos蛋白表達(dá)的變化與對(duì)照組（53.98±2.02）相比，在VLPO腦區(qū)微量注射L-Glu后，檢測(cè)到大鼠的TMN區(qū)域c-Fos表達(dá)量（21.82±1.22）明顯減少，IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，軟件分析t=11.10（P<0.01）。
　　結(jié)論:
　　存在于VLPO和TMN的代謝型谷氨酸