人臍帶間充質(zhì)干細胞移植對實驗性大鼠腦出血作用研究.pdf

1、目的:將人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUMSCs)移植到大鼠腦出血模型,觀察移植細胞在大鼠出血損傷腦組織中的存活、遷徙和神經(jīng)分化情況,探討hUMSCs移植對大鼠腦出血后神經(jīng)功能恢復的影響及其作用機制,為hUMSCs在神經(jīng)科學領(lǐng)域的臨床應用提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:無菌條件下收集足月妊娠剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,D-Hank’s洗去血管內(nèi)的殘存血,剔

2、除臍帶動靜脈,將剩余的組織剪碎至1mm3大小的組織塊,0.2％膠原酶Ⅱ消化,在含有20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2ng/ml表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L-glutamine,L-Glu)、100 U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)。觀察原代培養(yǎng)細胞的形態(tài)學變化,當細胞達到融合狀態(tài)時,加入0.2

3、5%胰酶-1 mM EDTA消化細胞,并傳代。
　　 收集消化后的細胞,以流式細胞法行細胞表型檢測,包括PE-CD11b,PE-CD45,PE-CD73,PE-CD90,PE-CD105,PE-HLA-DR(HLA-Ⅱ),FITC-CD19,和FITC-CD34并以FITC或PE標記的小鼠IgG1作為同型對照。
　　 選取體重在270-300 g之間的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,根據(jù)包新民《大鼠腦立

4、體定位圖譜》定位,用直徑1mm的牙科鉆頭在大鼠右側(cè)顱骨(AP=-0.5 mm;ML=3.0 mm)鉆孔,將微量注射器固定在立體定向架上,取膠原酶Ⅶ水溶液2 u1,以前囟為參照點緩慢注射到右側(cè)尾狀核頭部(AP=-0.5 mm;ML=3.0 mm;DV=5.5 mm),建立大鼠腦出血模型(intracerebral hemorrhage,ICH)。腦出血模型建立成功后24 h,采用改良神經(jīng)功能缺失評分(modified neurologic

5、al severity score,mNSS)對實驗動物進行神經(jīng)行為學評價,選取評分在7-12分間(中度損傷)大鼠納入實驗,隨機分為三組:(1)hUMSCs移植組,n=20;(2)磷酸鹽緩沖液(PhosphateBuffered Saline,PBS)對照組,n=20;(3)假手術(shù)組(sham組),n=5。
　　 將大鼠再次麻醉,頭部固定于立體定向架上。用10μL的Hamilton注射器,將1,1’-雙十八烷-3,3,3’,3-

6、四甲基吲哚羰花青-高氯酸鹽(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)標記的hUMSCs緩慢注射到hUMSCs組大鼠的右側(cè)出血灶區(qū)域邊緣(AP=-0.5mm ML=3.0 mm DV=3.5 mm)。每只大鼠接受10μL注射,共2×105細胞。拔針后用醫(yī)用生物蛋白膠將注射針孔及骨孔封閉。PBS對照組依同樣方法注入等量的PBS替代hUMSC

7、s。
　　 細胞移植后1、7、14、21、28、35 d對所有大鼠進行mNSS評分;將大鼠處死迅速斷頭取出全腦連續(xù)冰凍切片,免疫熒光染色檢測DiI標記hUMSCs在出血腦組織中存活、遷徙以及成熟神經(jīng)元標志-微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein2,MAP2)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志-膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達情況。采用SPSS

8、15.0for Windows統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:細胞培養(yǎng)第2 d即可見有少量形態(tài)各異的貼壁細胞,散在分布。1W左右時,貼壁細胞形成集落,以后見成纖維細胞樣克隆形成,克隆呈放射狀生長。在培養(yǎng)2 W,細胞接近90%匯合時,經(jīng)消化后按1:2的比例將細胞傳代。傳代后數(shù)小時內(nèi)可見其迅速貼壁,1 W左右達到90%～95%匯合程度,低倍鏡下細胞呈排列緊密的漩渦樣結(jié)構(gòu)。
　　 流式細胞檢測顯示這些細胞均一地

9、高表達MSCs標志CD73、CD90、CD105。不表達造血系標志CD34、CD45,中性粒細胞標志CD11b,人B細胞標志CD19。對組織相容性免疫表型的分析顯示hUMSCs不表達人白細胞抗原HLA-DR(HLA-Ⅱ)。
　　 細胞移植后24 h,huMSCs移植組、PBS對照組大鼠的mNSS評分之間沒有顯著性差異(P＞0.05),但與假手術(shù)組比較,均存在顯著性差異(P＜0.05)。細胞移植后7～35 d,hUMSCs組和PB

10、S對照組動物的mNSS評分均有不同程度分值下降,但hUMSCs組較PBS組下降更為明顯(p＜0.05)。hUMSCs移植組大鼠在肌力、反應力、平衡感以及反射等各個方面較PBS組改善更為顯著。雖然,hUMSCs移植組不同程度降低了腦出血后神經(jīng)功能評分,但部分指標與假手術(shù)組相比,仍有明顯差異(p＜0.05)。
　　 免疫熒光染色證明,hUMSCs移植后35 d可以有一定數(shù)量的hUMSCs在宿主腦內(nèi)存活,除了部分細胞聚集存在于注射區(qū)及

11、針道內(nèi)外,絕大多數(shù)移植細胞分布在出血損傷區(qū)周圍。此外,移植組的對側(cè)大腦也發(fā)現(xiàn)了少量移植細胞。在熒光顯微鏡下還發(fā)現(xiàn),部分hUMSCs遷移插入到血管結(jié)構(gòu)當中并沿血管走向方向排列,圍成管狀的紅色熒光結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色證實其中的部分移植細胞可以表達MAP2、GFAP。但值得注意的是:這些表達MAP2或GFAP的移植細胞并不具有典型的神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的形態(tài)。
　　 結(jié)論:本研究證實了人臍帶富含MSCs,可在體外進行分離、培養(yǎng)、擴增傳代。并