創(chuàng)建快速進化策略研究鹵醇脫鹵酶碳末端功能.pdf

1、鹵醇脫鹵酶，是一類存在于微生物降解有機鹵化合物代謝途徑中的關鍵酶之一，它不僅可以通過分子內親核取代機制，催化鄰鹵醇轉化生成環(huán)氧化物和鹵化氫，還能在一系列親核試劑N3-、CN-和NO2-等介導下，高效高選擇地催化其逆反應-環(huán)氧化物的開環(huán)反應，可以用來合成光學純的環(huán)氧化物以及β-取代醇等一系列高價值手性藥物中間體。因此，該酶具有十分重要的工業(yè)應用前景。
　　通過對目前研究較為廣泛的三類鹵醇脫鹵酶進行氨基酸序列同源性比對分析，我們發(fā)現(xiàn)來

2、源于放射形土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium radiobacter AD1）中的鹵醇脫鹵酶（HheC），在其碳末端與另兩類鹵醇脫鹵酶存在著顯著的序列特征差異，即前者擁有長于另兩類酶約10個氨基酸的碳末端區(qū)域。相關研究表明，這段看似冗長的碳末端區(qū)域，對鹵醇脫鹵酶行使催化功能具有十分重要的作用，但對其具體的調控機制還缺乏深入地研究。為了更高效地研究碳末端的具體功能，本論文在迭代式飽和突變策略（Iterative Saturation

3、Mutagenesis，ISM）的基礎上，創(chuàng)建了兩種多位點快速進化策略。通過運用相關策略，系統(tǒng)地研究和揭示了鹵醇脫鹵酶碳末端的具體功能以及相應的調控機制。具體研究內容如下：
　　（1）使用定點缺失突變技術，逐一研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個氨基酸位點在酶催化反應過程中的作用。對所獲得的10個碳末端氨基酸缺失突變體Δ1~Δ10，進行了表達純化和功能檢測。研究發(fā)現(xiàn)：碳末端氨基酸的缺失，對鹵醇脫鹵酶的催化活性有相當顯著的負效應，其中缺失突

4、變體Δ7~Δ10幾乎完全喪失了催化活性。此外，碳末端氨基酸缺失后，還對酶的熱穩(wěn)定性具有十分顯著的負效應。這些結果表明，該碳末端區(qū)域對鹵醇脫鹵酶行使催化功能是必不可少的。
　　（2）使用單點飽和突變技術，系統(tǒng)地研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域每個氨基酸位點在酶催化反應過程中的具體功能及調控機制。通過基于酶催化活性和熱穩(wěn)定性的文庫篩選，獲得了20個單點優(yōu)勢突變體，并對其進行表達純化和功能檢測。研究發(fā)現(xiàn)：碳末端關鍵氨基酸位點249和252~25

5、4發(fā)生突變后，對鹵醇脫鹵酶的催化活性和熱穩(wěn)定性分別具有十分明顯地增強作用，證實了碳末端區(qū)域對催化活性和熱穩(wěn)定性均具有一定的調控功能。其中，碳末端關鍵氨基酸位點253和254，被證實能夠在不影響鹵醇脫鹵酶催化活性情形下，獨立地調控酶的熱穩(wěn)定性。同源建模分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢突變體P253D和P253N，在氨基酸位點253和254之間增加了兩個氫鍵，能夠較好地穩(wěn)定整個碳末端區(qū)域的構象，使得它們的熱穩(wěn)定性明顯改善。相關結果表明：碳末端區(qū)域內氨基酸之間

6、的氫鍵網(wǎng)絡，對其維持和調控鹵醇脫鹵酶的熱穩(wěn)定性有著不可替代的作用。
　　（3）創(chuàng)建高效的多位點快速進化策略，用于后續(xù)進一步研究和調控鹵醇脫鹵酶碳末端功能。首先，在ISM策略的基礎上，結合簡并密碼子設計工具DC-Analyzer，創(chuàng)建了非連續(xù)多位點快速進化策略，并成功用于增強鹵醇脫鹵酶的催化活性實例中。在對5個氨基酸位點的改造研究中，通過篩選約900個單克隆，獲得了催化活性較野生型提高9.3倍的高效突變體。但是，該策略用于含有多個連

7、續(xù)或者相鄰位點的改造研究時，基于DC-Analyzer所設計的引物數(shù)目會大大增加。隨后，針對DC-Analyzer的應用局限，成功地開發(fā)了適用于連讀多位點突變重組的簡并密碼子工具MDC-Analyzer。在此基礎上，創(chuàng)建了連續(xù)多位點快速進化策略，并成功運用于提高鹵醇脫鹵酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性實例中。在對6個和7個氨基酸位點的改造研究中，通過篩選1,151和384個單克隆，分別獲得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍熱失活半衰期的高效

8、突變體。這些結果表明，本論文所創(chuàng)建的快速進化策略，能夠高效便捷地用于快速提高生物催化劑的催化特性。
　?。?）運用所創(chuàng)建的快速進化策略，研究鹵醇脫鹵酶碳末端區(qū)域關鍵氨基酸位點245，249，252，253和254的重組效應，進一步地調控和改善酶的催化活性以及熱穩(wěn)定性。首先，使用非連續(xù)多位點快速進化策略，研究碳末端區(qū)域關鍵氨基酸位點245、249和252的重組效應。研究發(fā)現(xiàn)，這3個氨基酸位點對酶的催化活性和熱穩(wěn)定性都有相當明顯的加和

9、效應，并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶5.0倍催化活性以及3.1倍熱失活半衰期的高效突變體DL10。隨后，運用連續(xù)多位點快速進化策略，在DL10的基礎上，進一步研究關鍵氨基酸位點253和254的重組效應。研究發(fā)現(xiàn)，這2個氨基酸位點發(fā)生突變后，能夠在不影響DL10催化活性的前提下，獨立地調控酶的熱穩(wěn)定性，并且篩選獲得了高于野生型鹵醇脫鹵酶4.0倍催化活性以及17.8倍熱失活半衰期的高效突變體PX14?？梢?，碳末端氨基酸調控鹵醇脫鹵酶的催