SNX10、SNX11蛋白功能研究.pdf

1、內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)是真核調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的一個(gè)重要手段。蛋白需要通過(guò)內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間定位到適當(dāng)?shù)膮^(qū)域以發(fā)揮它正常的生理功能。同時(shí)內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)也可以通過(guò)修飾和降解等方法調(diào)節(jié)蛋白的活性。Sorting Nexins(SNXs)是一個(gè)新的與內(nèi)涵體分選相關(guān)蛋白家族。它們以PX結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣鹘Y(jié)構(gòu)。PX結(jié)構(gòu)域是個(gè)磷酸肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域，SNXs通過(guò)PX與磷酸肌醇的結(jié)合定位到內(nèi)涵體膜上。由于SNXs在除PX結(jié)構(gòu)域外的蛋白結(jié)構(gòu)上較大的差異，這些成員在多樣的內(nèi)涵體轉(zhuǎn)

2、運(yùn)通路上發(fā)揮功能。
　　 SNX10，SNX11是SNXs家族結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一類蛋白，除了PX結(jié)構(gòu)域外不含有其它已知的功能性結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)蛋白在氨基酸序列具有很高的相似性，在進(jìn)化上也最為接近。但它們的功能完全未知。我們實(shí)驗(yàn)室第一次發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中高表達(dá)SNX10可以誘導(dǎo)出巨大的空泡結(jié)構(gòu)，但對(duì)這個(gè)過(guò)程的分子機(jī)制并不清楚。我們發(fā)現(xiàn)SNX10主要定位在Rab5陽(yáng)性的早期內(nèi)涵體上，而誘導(dǎo)出的空泡則顯示出晚期內(nèi)涵體標(biāo)記，說(shuō)明SNX10可能開(kāi)啟了

3、一條通路，加速了由早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變。而在這個(gè)過(guò)程中抑制Rab7可以起到抑制SNX10表型的作用，而Rab5抑制則不產(chǎn)生影響，說(shuō)明這條通路不依賴于Rab5而依賴于Rab7。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)SNX11可以特異性的抑制SNX10的表型。SNX11在早期和晚期內(nèi)涵體上都有部分定位。當(dāng)SNX11與SNX10一起轉(zhuǎn)染入細(xì)胞時(shí)，SNX11與SNX10共定位在早期內(nèi)涵體上，并抑制Rab7標(biāo)記的晚期內(nèi)涵體的擴(kuò)大。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，V-ATPase

4、參與了SNX10誘導(dǎo)的空泡化。SNX10與V-ATPase的V1D亞基相互作用，由此V-ATPase被異常激活可能是增強(qiáng)的內(nèi)涵體膜融合和酸化的原因。SNX11也與V1D亞基相互作用。SNX11，SNX10對(duì)V1D的結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，并且SNX11表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力。V-ATPase的異?；钚砸彩荲acA誘導(dǎo)細(xì)胞空泡的原因，我們發(fā)現(xiàn)SNX11也可以抑制VacA誘導(dǎo)的空泡的形成。以上這些結(jié)果說(shuō)明了SNX10，SNX11通過(guò)V-ATPase調(diào)

5、節(jié)內(nèi)涵體。
　　 我們進(jìn)一步在斑馬魚(yú)中研究SNX10的生理功能。用morpholino的方法敲降SNX10后，可以破壞斑馬魚(yú)的左右不對(duì)稱發(fā)育。KV(Kupffer's Vesicle)是決定斑馬魚(yú)作用不對(duì)稱發(fā)育的重要器官，而KV中纖毛在其發(fā)揮功能的關(guān)鍵。我們發(fā)現(xiàn)在注射SNX10 morpholino的胚胎中，KV的纖毛形成受到抑制。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明SNX10調(diào)節(jié)細(xì)胞的纖毛發(fā)生。SNX10定位在纖毛基體的周?chē)?。?fù)責(zé)高爾基體與基體

6、之間膜泡運(yùn)輸?shù)腞ab11與SNX10表現(xiàn)出部分功定位。與纖毛膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白BBS4，IFT88也表現(xiàn)出與SNX10的共定位。而用siRNA敲降SNX10可以阻礙細(xì)胞中的纖毛形成。因?yàn)镾NX10/V-ATPase一起調(diào)節(jié)內(nèi)涵體形態(tài)，所以V-ATPase也可能參與對(duì)纖毛膜泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控。用V1D和Vod1的GFP融合蛋白我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase定位在基體上，與纖毛運(yùn)輸相關(guān)的蛋白表現(xiàn)出共定位。在細(xì)胞中敲降V-ATPase可以抑制纖毛的形成，

7、而在斑馬魚(yú)中敲降V-ATPase則在KV，原腎管，側(cè)線等多個(gè)器官中造成纖毛缺陷。而且在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，SNX10和V-ATPase對(duì)纖毛的調(diào)節(jié)都表現(xiàn)出協(xié)同作用。這些結(jié)果支持SNX10/V-ATPase通過(guò)膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)纖毛發(fā)生的假設(shè)。在進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)V-ATPase在中心體上定位依賴于SNX10，在敲降SNX10的細(xì)胞中，V-ATPase在中心體上定位的比例明顯降低。這說(shuō)明了在這過(guò)程中SNX10對(duì)V-ATPase的調(diào)節(jié)方式。同

8、時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)SNX10，V-ATPase的siRNA可以阻止Rab8向纖毛的轉(zhuǎn)運(yùn)，這一結(jié)果從另一側(cè)面說(shuō)明在纖毛發(fā)生過(guò)程中SNX10/V-ATPase對(duì)膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)：
　　 1，SNX10，SNX11調(diào)節(jié)早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)變，這個(gè)調(diào)節(jié)是通過(guò)V-ATPase來(lái)實(shí)現(xiàn)的。SNX10和SNX11都與V-ATPase的V1D亞基相互作用，
　　 2，SNX11通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的與V1D結(jié)合來(lái)抑