17β-雌二醇對骨性關節(jié)炎軟骨細胞mTOR信號通路影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究17β-雌二醇（E2）是否可以激活人軟骨細胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，以及如何激活或通過什么樣的途徑激活mTOR信號通路。通過對這一新的分子機制的探索可能揭示雌二醇對人軟骨細胞的生理作用。我們的研究可能為mTOR作為OA治療的潛在靶點提供依據(jù)及對mTOR有效的抑制劑的研究提供參考。
　　方法：
　　對人永生化軟骨細胞細胞系TC28a2和C28/I2E2在雷帕霉素（mTOR抑制劑）、E

2、2、LY294002（PI3K抑制劑）、或E2與雷帕霉素或LY294002等聯(lián)合治療條件下進行孵育。然后，對S6K1、p-S6K1蛋白、蛋白激酶B（AKT），和p-AKT的蛋白水平進行Western blot分析，MMP3或MMP13的mRNA水平進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、免疫共沉淀（CO-IP）和蛋白質印跡法(WB)分析以驗證雌激素受體α和mTOR信號通路之間的相互作用。
　　結果：
　　p-S6K1

3、和p-AKT（半小時和一小時）在與E2一起培養(yǎng)的細胞系TC28a2和C28/12E2中均明顯升高。mTOR不影響p-AKT的水平，但當與LY294002（PI3K抑制劑）、或E2與LY294002組合的條件下培養(yǎng)，其水平明顯減少。當與LY294002一起培養(yǎng)的條件下p-S6K1水平明顯減少，但這種影響可由E2與LY294002組合條件下逆轉。在與E2一起培養(yǎng)的條件下兔抗mTOR抗體可以與ERα發(fā)生共沉淀反應。另外，E2可以通過mTOR信