適用于哺乳動物細胞基因調控的人工核酶核糖開關的設計.pdf

1、核酶核糖開關（ribozyme based riboswitches）是 mRNA上一段能夠調控基因表達的序列，由具有不可逆自我裂解活性的核酶和能夠特異性識別配體的適體連接而成。其中核酶結構域的活性受到適體結構域的別構調控，核酶的裂解使得所在 mRNA斷裂，基因表達量下降。這種僅基于 RNA的基因調控系統(tǒng)體積小、幾乎沒有免疫原性，較常用的啟動子誘導型調控系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢，尤其是它們與與 AAV等基因治療載體良好的兼容性，都展現出廣闊的

2、應用前景。
　　現有的核酶核糖開關調控倍數過低，基礎表達量較大，調控不夠嚴謹；其基本元件的選擇與結構的組裝等仍需要優(yōu)化，以實現基因表達性能達到最佳。目前最常用的優(yōu)化方法是文庫篩選。但對于哺乳動物細胞來說，篩選過程耗時長，且目的性差，不能很好地滿足優(yōu)化的需求。
　　基于核酶核糖開關的作用原理進行合理設計，是一種非常有前途的優(yōu)化方法，但目前囿于對其作用模式認識尚膚淺，還沒有合適的模型可利用。本文綜合分析已報道核糖開關序列的作用機

3、制及結果，以核酶核糖開關主要構象間的轉換為核心，系統(tǒng)考慮哺乳動物細胞內基因表達的主要過程，構建了其調控基因表達的數學模型，希望該模型能全面解釋各種核酶核糖開關的作用原理。根據該模型，本文提出核糖開關主要構象間自由能變化是基因基礎表達量的決定性因素，認為此因素對于核酶核糖開關性能的優(yōu)化具有更好的參考價值。
　　基于以上模型，本文設計了一種新型核酶核糖開關。為維持核酶結構域的活性，將茶堿適體連接到錘頭狀核酶的莖 III上，而不是已報道

4、核酶核糖開關所常用的莖 II位置。雙熒光素酶分析實驗表明，新設計的核酶核糖開關在 Hela細胞中呈現出明顯的正調控性能，在1000μM茶堿濃度下，海腎螢光素酶報告基因的表達水平增加90％。與已有的同類型核酶核糖開關相比，基礎表達量降低了三分之二。與已有核酶核糖開關比較，新設計的核酶核糖開關性能有明顯的提高。
　　我們又進一步通過點突變實驗，改變核糖開關主要構象間的自由能差值，結果顯示基因的基礎表達量變化基本符合預期，加深了我們對核