番茄SI-FIL1轉錄激活域EPR1的鑒定及其磷酸化對轉錄調控功能的影響研究.pdf

1、乙烯是一種重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育過程中起著重要調控作用。植物在種子萌發(fā)、側根發(fā)育、莖生長、果實發(fā)育成熟、器官的衰老脫落等生命活動中存在著各種乙烯應答反應。研究表明，植物中有幾百個基因受到乙烯的調控。對擬南芥以及番茄乙烯突變體的大量研究表明，乙烯應答反應存在明顯的時空特異性，相同的乙烯濃度在植物不同的組織或不同的發(fā)育階段會引起完全不同的乙烯應答反應。
　　 EIN3/EILs(Ethylene-Insensitive3，

2、EIN3；EIN3-Like，EIL)蛋白家族是乙烯信號通路中一個重要的正調控因子。EIN3/EILs存在于細胞核，作為一種轉錄因子能與乙烯應答基因啟動子的特異序列結合，并激活基因的轉錄。EIN3/EILs蛋白能直接調控ERF(Ethylene Response Factor)基因家族的轉錄，研究者推測EIN3/EILs蛋白家族通過調控不同的ERF基因從而引起各類具有時空特異性的乙烯應答反應。然而，EIN3/EILs是一個較小的蛋白家族

3、，已知在擬南芥中存在四種EIN3/EILs蛋白，在番茄中也僅存在四種EIN3/EILs蛋白。研究表明EIN3/EILs蛋白存在功能冗余，并且EIN3/EILs基因的轉錄并不受乙烯調控。那么，EIN3/EILs蛋白家族是如何響應乙烯信號并調控下游數(shù)量龐大的乙烯應答基因而最終引起多樣化的乙烯應答反應呢?對此目前尚無任何報道。因此，深入研究EIN3/EILs蛋白家族的轉錄調控機理將有助于闡明乙烯應答反應調控過程。研究結果具有重要的理論意義。<

4、br>　　 磷酸化修飾對轉錄因子轉錄活性的調節(jié)作用已得到廣泛的認同。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)番茄S1-EIL1蛋白質的轉錄調控功能受到磷酸化的調控。本研究中，在Sl-EIL1中分析鑒定了EPR1磷酸化功能域，并通過瞬時表達熒光檢測、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)以及轉基因分析等技術對EPR1功能進行了深入研究，分析了EPR1磷酸化在Sl-EIL1轉錄調控過程中的作用機理，并初

5、步建立了EIN3/EILs蛋白起始轉錄調控模式。主要研究結果與結論如下：
　　 (1)EPR1功能域的預測與分析。采用Group-based Prediction system(GPS2.1)軟件預測分析了EIN3/EILs蛋白家族高度保守區(qū)域內的磷酸化位點，結合ExASy在線PROSITE分析軟件，對所預測的8個保守磷酸化位點進行進一步的分析鑒定。推測在EIN3/EILs蛋白的DNA結合功能域的N端存在一個谷氨酰胺富集區(qū)(Q-

6、richdomain)，并具有一個高度保守的PKA磷酸化位點，該區(qū)域具有明顯的轉錄激活功能域特點，我們將它命名為EIN3/EILs-phosphorylation region1(EPR1)。
　　 (2)EPR1功能域對SL-EIL1轉錄調控功能的影響。對Sl-EIL1的EPR1堿基位點進行PCR位點突變，獲得突變基因Sl-EM1和Sl-EM2(Sl-EIL1-mutant1 andSl-EIL1-mutant2)。采用原生質

7、體轉化瞬時表達技術以及轉基因分析等方法，對Sl-EIL1、Sl-EM1和Sl-EM2的功能進行分析比較，確認EPR1功能域對Sl-EIL1的轉錄調控功能有著密切的影響。
　　 (3)EPR1功能域作用機理的研究。采用BiFC技術分析比較了Sl-EIL1、Sl-EM1和Sl-EM2的二聚化及異聚化活性，發(fā)現(xiàn)EPR1功能域對Sl-EIL1的二聚化活性有著重要的影響，因此推測EPR1功能域通過調控Sl-EIL-1的二聚化從而影響SL-