葫蘆素B對(duì)缺氧性肺動(dòng)脈高壓的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一種由長(zhǎng)期慢性缺氧引發(fā)的進(jìn)行性肺心疾病。持續(xù)低氧造成肺動(dòng)脈壓力升高、肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重塑(肺動(dòng)脈管壁增厚及管腔異常狹窄),隨病情進(jìn)一步發(fā)展,右心室負(fù)荷持續(xù)加重,進(jìn)而導(dǎo)致病人右心室衰竭及死亡。HPH的發(fā)病率和死亡率都較高,且目前尚無(wú)有效的治療方法。
　　在HPH的病理發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中,缺氧引發(fā)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary

2、artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖和肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)都是非常關(guān)鍵的因素。因此,抑制PASMCs過(guò)度增殖及緩解肺部炎癥成為防治HPH的熱點(diǎn)思路。葫蘆素B(cucurbitacin B,CuB)是一種從葫蘆科植物中提取的四環(huán)三萜類(lèi)化合物,具有較強(qiáng)的抗炎、抑制癌癥細(xì)胞增殖、抗氧化等活性,可在多種病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,如抑制乳腺癌、肝癌及肺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)癌癥細(xì)胞凋亡;誘發(fā)心肌細(xì)胞自噬;抑制巨噬細(xì)胞釋放

3、炎癥因子;保護(hù)酒精所致的急性肝損傷性黃疸等。但CuB在HPH中的作用尚無(wú)報(bào)道。因此,本課題旨在通過(guò)建立HPH小鼠模型,探究CuB是否能夠抑制PASMCs增殖及緩解肺部炎癥來(lái)降低模型組小鼠的肺動(dòng)脈壓力、改善模型組小鼠的肺動(dòng)脈血管重構(gòu)以及右心室肥厚,以達(dá)到防治HPH的目的。
　　方法:
　　1.HPH小鼠模型建立及分組
　　選取32只雄性昆明小鼠(25-28g),隨機(jī)分成4組,每組8只:①常氧+生理鹽水組;②常氧給予CuB

4、組;③低氧+生理鹽水組;④低氧給予CuB組。將常氧組小鼠置于常氧(含21％O2)環(huán)境中,低氧組小鼠置于缺氧箱內(nèi)(含10％O2),連續(xù)缺氧四周。
　　各組小鼠在缺氧前預(yù)給藥一周后,連續(xù)給藥四周,直至缺氧結(jié)束。第①組和第③組小鼠每天腹腔注射生理鹽水,第②組和第④組小鼠每天腹腔注射CuB(1mg/kg)。
　　2.血流動(dòng)力學(xué)與形態(tài)學(xué)分析
　　缺氧四周后,將各組小鼠麻醉,用聚乙烯(PE)導(dǎo)管經(jīng)頸外靜脈插入其右心室,測(cè)量右心室平

5、均收縮壓(right ventricular mean systolic pressure,RVSP),取出心臟,將右心室(right ventricle,RV)與左心室+室間隔(left ventricle+septum,LV+S)分離,計(jì)算其重量之比,用以評(píng)價(jià)右心室增厚程度。
　　將小鼠右肺組織固定(浸于4％多聚甲醛)、石蠟包埋、切片,蘇木精伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)觀察肺動(dòng)脈形態(tài)

6、。Image Pro Plus軟件分析肺動(dòng)脈外徑、內(nèi)徑、中膜面積、血管總面積,計(jì)算中膜厚度百分比(WT％)及面積百分比(WA％),以評(píng)價(jià)肺動(dòng)脈增厚程度。
　　3.肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)重建免疫組化分析
　　小鼠肺組織經(jīng)石蠟切片后,用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle action,α-SMA)抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,然后分析測(cè)量α-SMA的光密度值(OD值),計(jì)算肺動(dòng)脈肌化比例,以評(píng)價(jià)肺動(dòng)脈重塑程度。
　　4.肺

7、部炎癥分析
　　提取各組小鼠肺組織中RNA,利用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)與白介素-6(interleukin-6,IL-6)mRNA的表達(dá)情況。
　　提取各組小鼠左肺組織蛋白,利用蛋白免疫印跡(Wester

8、n Blot)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcrlption factorκB,NF-κB)蛋白表達(dá)情況。
　　5.PASMCs原代培養(yǎng)及增殖分析
　?、贌o(wú)菌條件下,分離3周齡左右昆明小鼠的肺動(dòng)脈,采用Ⅱ型膠原酶消化的方法,原代培養(yǎng)PASMCs,2-7代可用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分成6組:常氧組,低氧組,低氧+10μM CuB組,低氧+20μM CuB組,低氧+30μM CuB組,以及低氧+40μM CuB組。
　

9、　②MTT法檢測(cè)低氧缺氧24h后,CuB對(duì)PASMCs增殖的影響。
　?、踂estern blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxla inducible factor-1α,HIF-1α)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)與信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1

10、.與常氧組相比,小鼠缺氧四周后,RVSP、RV/(LV+S)都顯著升高。給予CuB處理后,RVSP、RV/(LV+S)顯著降低。
　　2.與常氧組相比,小鼠缺氧四周后,肺動(dòng)脈WT％、WA％、α-SMA的OD值及肌化比例顯著升高。給予CuB處理后,肺動(dòng)脈WT％、WA％、α-SMA的OD值及肌化比例顯著降低。
　　3.與常氧組相比,缺氧組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平和NF-κBp65蛋白表達(dá)水平較常氧組顯著

11、升高。CuB可顯著抑制缺氧小鼠肺組織中TNF-α、IL-6的mRNA過(guò)表達(dá)和NF-κB p65蛋白過(guò)表達(dá)。
　　4.與常氧組相比,缺氧顯著促進(jìn)PASMCs的增殖能力。CuB處理后,細(xì)胞增殖能力顯著下降。
　　5.與常氧組相比,缺氧后,HIF-1α、p-Akt與p-STAT3蛋白在PASMCs中的表達(dá)顯著上調(diào)。CuB劑量依賴(lài)性抑制以上蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.CuB能夠降低缺氧性肺動(dòng)脈高壓模型小鼠的肺動(dòng)脈血