表面等離子共振生物傳感器快速檢測點(diǎn)突變的新方法研究.pdf

1、近年來，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為一類能夠在基因組DNA中穩(wěn)定遺傳的生物標(biāo)記物被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。研究表明，一些存在于基因編碼序列或調(diào)控區(qū)域的單堿基突變能夠?qū)е禄蚬δ艿奈蓙y，從而影響個體對某些特定疾病的易感性和對藥物反應(yīng)的差異性。因此，單堿基突變的檢測對于疾病的風(fēng)險評估、臨床診斷和治療發(fā)揮著重要的作用，特別是對于一些遺傳性疾病的早期診斷以及指導(dǎo)個性化用藥意義重大。到目前為止，許多新興的方法已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于SNP

2、s的檢測，其中生物傳感器發(fā)展尤為迅速，特別是表面等離子共振(SPR)生物傳感器，已經(jīng)發(fā)展成為了一種成熟的研究生物分子間相互作用的方法。SPR生物傳感器因其具有無需對分子進(jìn)行標(biāo)記、實時監(jiān)測動態(tài)反應(yīng)過程、分析性能優(yōu)越、樣本用量少、易于自動化、檢測周期短等其他傳統(tǒng)方法所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，在核酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物分子測定方面顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。本研究將基因芯片技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)與SPR傳感技術(shù)整合起來，利用了巰基自組裝以及DNA聚合酶對錯

3、配堿基的識別作用，原創(chuàng)性地提出了一種快速、簡便、實時、免標(biāo)記、高靈敏的點(diǎn)突變檢測方法。本論文研究工作主要包括以下兩個部分:
　　1.表面等離子共振生物傳感平臺的構(gòu)建
　　本實驗選用了BIACORE X分析系統(tǒng)和裸金芯片，采用分子自組裝技術(shù)在芯片金膜表面直接固定巰基修飾的捕獲探針構(gòu)建用于檢測的傳感芯片。在金膜表面，巰基被氧化后形成金硫鍵，由于Au-S鍵之間的共價結(jié)合力很強(qiáng)，從而保證了配體在芯片表面固定的穩(wěn)定性。用6-巰基-1-

4、己醇(MCH)對芯片表面進(jìn)行封閉，最大程度地減小非特異性吸附對響應(yīng)信號的影響。實驗過程中，選擇70μl的進(jìn)樣體積進(jìn)行樣本分析，分別對2μl/min、5μl/min、7μl/min、10μl/min的樣本流速進(jìn)行了優(yōu)化，考察了不同樣本流速對檢測信號的影響。該分析過程耗時較短，每次檢測僅需15分鐘。分別利用NaOH溶液和不同pH的Gly-HCl溶液對芯片表面進(jìn)行再生，優(yōu)化再生條件，結(jié)果表明，芯片再生效果好，可重復(fù)使用30次以上。
　　

5、2.基于DNA聚合酶核酸延伸反應(yīng)的單堿基突變的檢測
　　將第一部分所構(gòu)建的SPR生物傳感器應(yīng)用于聚合延伸反應(yīng)產(chǎn)物的檢測，建立一種靈敏性高、特異性好的點(diǎn)突變檢測新方法。在液相反應(yīng)中，利用DNA聚合酶對引物3'末端錯配構(gòu)象的識別作用，在適宜的緩沖液和溫度條件下，以待測靶序列為模板進(jìn)行核酸延伸反應(yīng)，進(jìn)而將反應(yīng)產(chǎn)物注入Biacore X SPR系統(tǒng)中與芯片金膜表面修飾的捕獲探針進(jìn)行雜交檢測。對引物延伸反應(yīng)條件（Mg2+濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)