TL1A活化滑膜成纖維細胞在類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、目的:類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜增生為特點，引起鄰近的軟骨組織和骨結構進行性破壞的慢性炎癥浸潤的多發(fā)性關節(jié)炎?；檐浌枪┙o營養(yǎng)，為關節(jié)提供潤滑液。滑膜襯里層由滑膜襯里層細胞構成，滑膜襯里層細胞被稱為滑膜細胞，由巨噬細胞樣和成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocytes，FLS)構成。盡管T、B淋巴細胞以及巨噬細胞都參與了RA的發(fā)病機制，但滑膜成纖維細胞在該疾病中

2、發(fā)揮重要的作用?；ひr里中FLS分泌的多種細胞因子能夠加劇關節(jié)局部炎癥反應導致軟骨組織受到侵蝕。既往研究表明，腫瘤壞死因子(TNF)與其相應受體結合后能夠啟動RA中炎癥的級聯反應，在組織損傷和骨質破壞中發(fā)揮了重要作用。腫瘤壞死因子樣配體1A(TL1A)屬于腫瘤壞死因子超家族成員，有研究發(fā)現，TL1A與RA的活動度密切相關。TNF-α和IL-β刺激RA患者FLS能夠產生TL1A，TL1A與其受體DR3結合后能夠誘導多種炎癥因子的生成和釋放

3、，從而放大炎癥效應。目前，大部分關于TL1A在RA中的體外研究都是以T細胞為靶點。本實驗通過對TL1A刺激FLS后產生炎癥因子的檢測分析以及對TL1A作用于FLS的機制研究，進一步探討RA中，TL1A在FLS中的作用，為TL1A在該疾病中的功能提供了一定的理論依據。
　　方法:(1)收集RA患者以及健康對照血清，通過ELISA方法檢測血清中TL1A的表達;
　　(2)體外培養(yǎng)RA患者FLS，TL1A處理細胞后檢測細胞中相關炎

4、癥因子mRNA的水平，ELISA檢測細胞培養(yǎng)基上清中的炎性因子濃度;
　　(3)TL1A刺激細胞前，用信號通路抑制劑處理細胞，通過對刺激后產生炎性因子表達水平的檢測，研究TL1A作用于FLS后所活化的信號通路;
　　(4)流式細胞術檢測FLS表面TL1A受體DR3，由于結果陰性，為證明TL1A如何作用于FLS，加入TNF受體拮抗劑處理細胞2小時，隨后以TL1A刺激，通過對刺激后所產生的炎性因子表達水平的檢測，研究TL1A與F

5、LS作用的機制;
　　(5)TL1A刺激FLS后棄去培養(yǎng)基洗凈殘留刺激劑，加入健康對照PBMC共培養(yǎng)3天，流式細胞術檢測Th17的分群情況;
　　(6)蛋白芯片檢測3株經TL1A處理48小時前后FLS培養(yǎng)基上清細胞因子水平，分析研究TL1A刺激FLS后所產生的細胞因子在RA中的用作。
　　結果:(1)ELISA檢測RA組與正常對照組血清中TL1A表達水平，RA組TL1A水平顯著高于正常對照組(P＜0.05)。
　

6、　(2)應用RT-PCR和ELISA檢測TL1A刺激FLS不同時間點(0，6，24，48 h)FLS產生炎性因子的表達情況。TL1A刺激FLS6h后提取mRNA，RT-PCR結果顯示刺激后IL-6和PGE2表達水平顯著升高(P＜0.05)，ELISA檢測IL-6表達水平結果顯示隨著刺激時間的延長，IL-6水平逐漸升高以48h最為顯著(P＜0.05)，PGE2的水平并未隨時間延長表現明顯趨勢，TL1A刺激組相較于未處理其水平都顯著升高(P

7、＜0.05)。
　　(3)在分別加入NF-κB、JNK抑制劑組中，TL1A刺激FLS產生IL-6水平相比未加入抑制劑直接刺激組顯著降低(P＜0.05)。TL1A刺激后FLS產生IL-6需通過NF-κB以及JNK的活化。
　　(4)FLS中未能檢測到DR3的表達。
　　(5)拮抗TNF受體1、2后加入TL1A刺激，結果顯示拮抗TNFR2后IL-6和PGE2水平顯著降低(P＜0.05)。TL1A能夠與FLS表面的TNFR2

8、結合發(fā)揮作用。
　　(6)PBMC與TL1A刺激后的FLS共培養(yǎng)，PBMC中Th17比例顯著上升(P＜0.05)。
　　(7)TL1A刺激FLS后培養(yǎng)基中大量趨化因子因子及生長因子水平升高。
　　結論:(1)TL1A促進RAFLS產生IL-6通過NF-κB和JNK的激活。
　　(2)TL1A通過與TNFR2結合作用于FLS促進IL-6的分泌。
　　(3)TL1A促進RAFLS產生IL-6進一步上調Th17。