膽汁酸分子與霍亂弧菌DsbA蛋白相互作用機(jī)制的研究.pdf

1、霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌，是人類傳染病霍亂的病原體，可引起感染者劇烈嘔吐，腹瀉，大量失水，甚至死亡?；魜y弧菌在宿主體內(nèi)，只有進(jìn)入腸道并定殖于小腸上皮細(xì)胞后，其致病性相關(guān)毒素基因tcp和ct才會被大量表達(dá)。通過對小腸提取物分離純化分析發(fā)現(xiàn)，腸道中的膽汁酸分子通過霍亂弧菌的DsbA蛋白使毒素基因調(diào)控蛋白TcpP形成更多具有功能的二聚體結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的毒素因子。敲除DsbA的編碼基因vcdsbA后，毒素基因的表達(dá)就不再受膽汁酸分子的誘導(dǎo)

2、，而且TcpP不能形成二聚體。因此，推測當(dāng)霍亂弧菌進(jìn)入人體腸道后，首先利用膽汁酸分子與DsbA的相互作用調(diào)控下游毒素基因網(wǎng)絡(luò)，從而產(chǎn)生大量的毒素因子。
　　為研究膽汁酸分子與DsbA的相互作用，首先將霍亂弧菌的DsbA蛋白編碼基因vc0034(vcdsbA)克隆至原核表達(dá)載體pET28a，轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用鎳離子樹脂純化，得到霍亂弧菌DsbA蛋白。然后利用等溫滴定量熱(ITC)試驗(yàn)檢測膽汁酸分子T

3、C與DsbA的互作情況。結(jié)果表明，TC與DsbA互作的平衡解離常數(shù)KD為0.93×10-4M，化學(xué)計量比n為1.17 Sites，焓變化ΔH為-3647 cal/mol，熵變化ΔS為6.22 cal/mol，二者反應(yīng)熱量變化很大且親和力很強(qiáng)，說明DsbA與TC確實(shí)存在相互作用。為了進(jìn)一步研究DsbA的生物學(xué)功能，進(jìn)行了胰島素還原酶試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DsbA還原酶活性受TC抑制。
　　為了進(jìn)一步確定DsbA與膽汁酸分子互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，

4、利用易錯PCR的方法構(gòu)建了突變文庫，并通過檢測含有pBBRLux熒光報告質(zhì)粒的菌株的熒光表達(dá)冷光值的方法進(jìn)行文庫篩選，對突變的vcdsbA基因進(jìn)行序列測定。最終，從近一萬個突變株中篩選到dsbAH113L，dsbAD135V，dsbAE188A三個對TC不敏感的疑似株。為了進(jìn)一步研究這三個位點(diǎn)的作用，在大腸桿菌中表達(dá)了DsbAH113L，DsbAD135V，DsbAE188A三個蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們在大腸桿菌dsbA缺失株中對TC較不敏感