長(zhǎng)春花堿和秋水酰胺誘導(dǎo)TK基因突變的比較研究及兩類(lèi)突變集落機(jī)制研究.pdf

1、非整倍體是人類(lèi)健康中非常嚴(yán)重的遺傳問(wèn)題，因此非整倍體誘變劑的檢測(cè)是非常重要。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)用人類(lèi)淋巴母細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)評(píng)價(jià)紡錘體毒物遺傳毒性的報(bào)道，本研究使用人類(lèi)淋巴母細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)，對(duì)非整倍體毒物的檢出能力以及P53蛋白對(duì)該試驗(yàn)體系檢出率的影響做一探討，同時(shí)對(duì)正常生長(zhǎng)和緩慢生長(zhǎng)突變集落產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行研究。 本課題分為以下三部分： 第一部分：長(zhǎng)春花堿3小時(shí)和24小時(shí)處理TK6細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)比

2、較研究。目的是比較長(zhǎng)春花堿不同處理時(shí)間對(duì)TK6細(xì)胞的誘變性。結(jié)果表明長(zhǎng)春花堿3h處理TK6細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)，其突變頻率與對(duì)照組相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而24h處理結(jié)果顯示其有明顯的誘變 性，表明長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)于紡錘體毒物等細(xì)胞周期依賴(lài)的誘變劑可能是必要的。 第二部分：長(zhǎng)春花堿和秋水酰胺誘導(dǎo)TK6和TK6-E6細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)比較研究。目的比較用人淋巴母細(xì)胞進(jìn)行TK基因突變?cè)囼?yàn)對(duì)紡錘體毒物的檢出能力以及P53蛋白對(duì)該體系

3、檢測(cè)能力的影響。結(jié)果顯示隨受試物濃度的增加細(xì)胞毒性指標(biāo)RS、RV、RSG和RTG值均而下降，表 明長(zhǎng)春花堿和秋水酰胺對(duì)TK6和TK6-E6細(xì)胞的毒性隨著濃度的增加而增大。相同劑量下，TK6-E6細(xì)胞的RS％和RSG％均比TK6高，提示TK6細(xì)胞對(duì)受試物的細(xì)胞毒性更敏感。隨著長(zhǎng)春花堿和秋水酰胺濃度的增加，除CCM處理的TK6-E6組外，TK6細(xì)胞和TK6-E6細(xì)胞的突變頻率逐漸上升，各劑量組與陰性對(duì)照相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且除了MF中

4、CCM5.0ng/ml組，其它相同劑量下，TK6的MF均低于TK6-E6細(xì)胞(p<0.05)。由于TK6-E6細(xì)胞的RS、RSG、RTG和MF均較TK6細(xì)胞高，接種平板總細(xì)胞數(shù)少于TK6細(xì)胞，且TK6-E6的群體倍增時(shí)間短于TK6細(xì)胞，故建議優(yōu)先用TK6-E6細(xì)胞。 第三部分：兩種類(lèi)型的突變集落的比較：目的是研究?jī)深?lèi)集落的形成機(jī)理。本部分采用 tk 基因雜合性丟失分析、微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性丟失分析和G帶核型分析，從分子水平和染色體

5、水平研究長(zhǎng)春花堿誘導(dǎo)的TK6 和TK6-E6細(xì)胞二類(lèi)集落的不同。 1．正常生長(zhǎng)集落和緩慢生長(zhǎng)集落表比較：結(jié)果顯示緩慢生長(zhǎng)的突變集落平均生長(zhǎng)速度慢于正常生長(zhǎng)的突變集落的；TK6-E6的SC生長(zhǎng)速度快于TK6細(xì)胞的SC的速度。長(zhǎng)春花堿和秋水酰胺誘導(dǎo)的TK6和TK6-E6細(xì)胞突變體中，SC在TK6-E6細(xì)胞中占主要比例。相同劑量下，TK6-E6的SC％高于TK6細(xì)胞的。兩類(lèi)細(xì)胞中，SC％與劑量之間無(wú)劑量-依賴(lài)關(guān)系。 2．正

6、常生長(zhǎng)和緩慢生長(zhǎng)突變集落tk基因位點(diǎn)雜合性丟失研究：本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)TK6和TK6-E6細(xì)胞自發(fā)和VBL誘發(fā)的突變集落進(jìn)行tk基因TKexon7雜合性丟失分析，結(jié)果表明不論自發(fā)或誘發(fā)的，正常生長(zhǎng)或緩慢生長(zhǎng)的突變集落中，tk基因位點(diǎn)雜合性丟失都是主要的突變事件。 3．兩類(lèi)集落17號(hào)染色體STR位點(diǎn)雜合性丟失情況分析：采用17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的5個(gè)STR位點(diǎn)(D17S932、D17S807、D17S785、D17S784、D17S928

7、)研究了TK6和TK6-E6細(xì)胞自發(fā)突變和VBL誘發(fā)的突變集落中染色體損傷范圍，兩種細(xì)胞正常生長(zhǎng)比緩慢生長(zhǎng)的突變集落染色體損傷范圍小。長(zhǎng)春花堿除了誘導(dǎo)TK6和TK6-E6細(xì)胞整條染色體丟失外，還可導(dǎo)致部分染色體損傷。 4．采用G顯帶技術(shù)分析了正常TK6和TK6-E6細(xì)胞核型以及長(zhǎng)春花堿誘導(dǎo)的TK6和TK6-E6細(xì)胞突變集落中染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常，探討正常生長(zhǎng)和緩慢生長(zhǎng)集落與他們遺傳特征關(guān)系。結(jié)果表明TK6細(xì)胞的正常核型為47，X

8、Y,+13，14q+?，21p+?，TK6-E6細(xì)胞的為47，XY,+13p+?14q+?，21p+?。兩類(lèi)集落中自發(fā)和誘發(fā)、正常和緩慢生長(zhǎng)的突變細(xì)胞之間，17號(hào)染色體異常的比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但從趨勢(shì)來(lái)講，兩類(lèi)細(xì)胞中VBL誘發(fā)的突變集落中17號(hào)染色體異常比例高于自發(fā)突變的集落，緩慢生長(zhǎng)的集落染色體異常比例高于正常生長(zhǎng)細(xì)胞的，提示增大樣本量，二者可能有差異。 總結(jié)： 1．長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)于紡錘體毒物等細(xì)胞周期依賴(lài)的誘變劑是