“補腎生髓成肝”關鍵蛋白質(zhì)相互作用的機制研究.pdf

1、目的:研究“補腎生髓成肝”治則治法的生物學基礎,分析補腎(左歸丸)調(diào)控骨髓間質(zhì)于細胞(MSCs)轉化為肝細胞這一過程中所涉及的關鍵蛋白質(zhì)靶點,為骨髓干細胞轉化為肝細胞的臨床運用和補腎治療肝病提供科學的實驗依據(jù),進一步揭示“腎生骨髓,髓生肝”和“肝腎同源”的科學內(nèi)涵,豐富“髓失生肝”新的病因病機和“補腎生髓成肝”新的治則治法,使中醫(yī)理論認識有所突破、有所發(fā)展。
　　 方法:本研究在“補腎生髓成肝”治則治法理論所具有的臨床和實驗研究

2、基礎上,運用蛋白質(zhì)組學的研究思路和研究方法技術整體分析補腎(左歸丸)調(diào)控骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)轉化為肝細胞這一過程中蛋白質(zhì)組的差異表達、確定關鍵蛋白質(zhì),并運用免疫共沉淀技術結合生物信息學分析研究其關鍵蛋白質(zhì)的相互作用。2 m齡Wistar大鼠(SPF級)40只,隨機分為左歸丸藥物血清組和空白血清組用于制備左歸丸藥物血清,按10 ml/kg/d劑量給予左歸丸灌胃,空白組給予同等體積的生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥15 d后頸動脈插管取血,25

3、00rpm離心20 min,取同組上層血清混合,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩＠? d齡Wistar乳鼠獲取肝組織,肝組織貼壁培養(yǎng)法獲得原代肝細胞,傳代后種植于六孔板中作為共培養(yǎng)體系的誘導源細胞。引進賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司OriCellTM Wistar大鼠骨髓間質(zhì)干細胞,復蘇培養(yǎng)后傳代于插入式培養(yǎng)皿,待細胞貼壁后將培養(yǎng)皿置于種有肝細胞的六孔板內(nèi),建立骨髓間質(zhì)干細胞.肝細胞共培養(yǎng)體系。共培養(yǎng)體系按組別分別加入10％

4、左歸丸藥物血清和10%空白血清,每10天更換共培養(yǎng)體系中的肝細胞1次以保證肝細胞增殖活力。插入式培養(yǎng)皿內(nèi)預先放置10%多聚賴氨酸包被的小玻片,定期收集細胞爬片用于指標檢測。PAS法檢測共培養(yǎng)7、15、30 d時插入式培養(yǎng)皿內(nèi)細胞爬片糖原表達,ICC法檢測共培養(yǎng)7、15、30d時插入式培養(yǎng)皿內(nèi)細胞爬片肝系細胞特異性標志物AFP、CK18、ALB表達,以原代培養(yǎng)的肝細胞爬片作為陽性對照,傳代3次的骨髓間質(zhì)干細胞爬片作為陰性對照,鏡下觀察(2

5、00×),隨機選取10個視野計數(shù)陽性細胞,將陽性對照片的陽性細胞率作為100%,比較兩組不同時間點的陽性細胞率(%)。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,陽性細胞率以-X±s表示,兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。在共培養(yǎng)15 d和30 d時收集插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞用于蛋白質(zhì)組學研究,配制RIPA裂解液提取誘導培養(yǎng)肝細胞的總蛋白樣本,利用SDS-PAGE結合凝膠圖像分析,確定差異表達的蛋白質(zhì)條帶,用干凈的手術刀切取差異條帶進行蛋

6、白質(zhì)質(zhì)譜分析。根據(jù)測定所得的肽段信息使用MASCOT軟件搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫,比對與測定肽段對應的蛋白質(zhì),軟件自動分析評定分數(shù)、45分以上為有效信息。檢索NCBI公共數(shù)據(jù)庫、InterPro數(shù)據(jù)庫和UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索相關蛋白質(zhì)的詳細信息,獲得蛋白質(zhì)家簇、區(qū)域、功能位點等描述以進行生物信息學分析,確定“補腎生髓成肝”關鍵蛋白質(zhì)。提取正常Wistar大鼠肝組織總蛋白樣本(非變性型),利用免疫共沉淀技術檢測“補腎生髓成肝”

7、關鍵蛋白質(zhì)14-3-3蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、組蛋白H4的相互作用蛋白,利用SDS-PAGE結合凝膠圖像分析確定蛋白表達條帶,用干凈的手術刀切取條帶進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析,質(zhì)譜分析結果進行生物信息學分析。運用DAVID工具分析,蛋白質(zhì)組中差異表達的蛋白給予功能注釋,并給予聚類分析和信號通路分析。給予蛋白的各種不同方式聚類分析,從PIR源數(shù)據(jù)庫給出的聚類圖。
　　 結果:骨髓間質(zhì)干細胞誘導培養(yǎng)3d后,10%含藥血清組有

8、少部分骨髓干細胞開始表現(xiàn)出肝細胞樣細胞形態(tài)、細胞呈多邊形、胞漿豐富、核大或多核,15d時約50%的細胞表現(xiàn)為肝細胞樣細胞形態(tài),30d時80%細胞呈肝細胞樣細胞形態(tài)。誘導培養(yǎng)30d時骨髓間質(zhì)干細胞誘導的肝細胞糖原染色陽性細胞率(81.39±3.12)大于誘導培養(yǎng)15d的肝細胞(19.88±2.07),差異具有顯著性、P＜0.05。誘導培養(yǎng)30d的肝細胞AFP陽性細胞率(3.74±0.47)顯著低于誘導培養(yǎng)15d的肝細胞(19.36±2.6

9、6)、P＜0.05。誘導培養(yǎng)30d的肝細胞CK18陽性細胞率(91.14±7.03)顯著高于誘導培養(yǎng)15d的肝細胞(59.21±3.61)、P＜0.05。誘導培養(yǎng)30d的肝細胞ALB陽性細胞率(88.72±4.35)顯著高于誘導培養(yǎng)15d的肝細胞(60.27±5.13)、P＜0.05。利用GIS300凝膠成像分析系統(tǒng)獲取凝膠圖像,進行圖像分析,選定差異條帶,選取30d組中灰度值強于15d組和未誘導組的條帶進行質(zhì)譜分析。根據(jù)質(zhì)譜分析所得肽

10、段信息檢索SwissProt56.6數(shù)據(jù)庫,種屬為大鼠,利用MASCOT軟件對各肽段評分,分值高于45為有意義信息。質(zhì)譜實驗中角蛋白、胰蛋白酶為常見干擾因素,因而從Mascot軟件檢索結果中去除角蛋白、胰蛋白酶選項,得到初步篩選結果,結合生物信息學分析確定關鍵蛋白質(zhì)14-3-3蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、組蛋白H4作為相互作用研究的釣餌蛋白。經(jīng)免疫共沉淀反應得到的關鍵蛋白質(zhì)相互作用蛋白結果,與H4特異性結合的蛋白有NPTX1

11、、CATA、OGG1、IMA5、Vimentin、GSTA5、TM196、、Nestin、DDX25;與GRP78特異性結合的蛋白有AL1A7、AL181、AL1A1、AL1A2、UD282,UD288,ACTB,GRK5,DPYS,GSTM1,GSTA2,GSTA3,G3P、ACSL1、ACSL5、PYC、GRP78、ECHP、TRHDE、CES3、ODP2、ARNT2、HMCS1、Nestin、CP2CN、CP2CB;與14-3-3

12、家族特異性結合的蛋白有Neuromedin-S、IMA5、EF2、CARD9、RAF1。生物信息學分析結果見附圖。
　　 結論:在本研究基于骨髓間質(zhì)干細胞-肝細胞共培養(yǎng)體系結合補腎(左歸丸藥物血清)進行調(diào)控的實驗條件下,利用蛋白質(zhì)組學的研究思路和研究技術,確定“補腎生髓成肝”關鍵蛋白質(zhì)至少包括14-3-3蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、組蛋白H4,與關鍵蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)多達30多種,這些蛋白質(zhì)的表達變化和相互作用構