青蒿琥酯對內毒素耐受小鼠的保護作用及其作用機制的初步研究.pdf

1、目的:
　　膿毒癥(sepsis)是由感染因素引起的全身炎癥反應綜合征(systemicInflammatory response syndrome，SIRS)，膿毒癥進一步發(fā)展導致的膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是臨床危重患者死亡的主要原因，病死率高達30％～70％。
　　膿毒癥的病理生理表現為炎癥風暴(cytokine storm)和

2、免疫抑制(immunosuppression)兩個階段。長期以來，炎癥風暴一直被認為是膿毒癥的主要特征，因此將膿毒癥的研究焦點放在炎癥風暴及其造成的MODS，并以此研究膿毒癥的防治措施，但是多種以抗炎為目的的治療策略卻均以失敗告終。近年來，來自臨床的報告顯示，雖然膿毒癥患者能度過前期的炎癥風暴階段，但是許多卻因后期的繼發(fā)性感染和MODS而死亡，而這與患者處在免疫抑制階段、機體對病原微生物的二次打擊(second hit)抵抗力降低密切相

3、關。單核/吞噬細胞是機體抵抗病原微生物的第一道防線，在識別、清除病原微生物以及抗原的處理、提呈中發(fā)揮重要作用。其功能抑制與機體對二次打擊抵抗力的降低密切相關。
　　細菌內毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide，LPS)是誘導膿毒癥的主要病原分子。內毒素耐受將導致機體的過度免疫抑制，使機體更易遭受病原微生物的再次攻擊。通過建立內毒素耐受模型可模擬臨床膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)，為尋找治療膿毒癥有效藥物發(fā)揮

4、重要作用。
　　抗瘧藥青蒿琥酯(Artesunate，AS)是含有倍半萜結構的青蒿素衍生物，具有水溶性好、毒性低等優(yōu)點。我們課題組在前期研究中發(fā)現青蒿琥酯具有顯著的抗炎作用，基于其抗炎作用我們發(fā)現青蒿琥酯對LPS攻擊小鼠、熱滅活大腸埃希菌(Escherichiacoli，EC)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)攻擊小鼠、大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistan

5、t Staphylococcus aureus，MRSA)活菌攻擊小鼠、盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)膿毒癥模型小鼠均具有顯著保護作用，該作用可能與其抑制TLR4、TLR9表達，降低LPS水平以及抑制NF-κB活性有關。
　　除具有顯著的抗炎作用外，有文獻報青蒿琥酯具有免疫調節(jié)作用。為研究青蒿琥酯是否可通過其免疫調節(jié)作用發(fā)揮對膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的治療作用，本課題擬在建立內毒素耐受及二

6、次打擊小鼠、細胞模型的基礎上，觀察青蒿琥酯對內毒素耐受二次打擊模型小鼠的保護作用及其可能機制，為尋找有效治療膿毒癥的藥物并拓寬青蒿琥酯的臨床適應癥提供實驗依據。
　　方法:
　　一、小鼠內毒素耐受模型的建立與評價
　　1.小鼠內毒素耐受模型的初步建立與評價
　　(1)模型的初步建立:連續(xù)5d腹腔注射1 mg/kg LPS后，于第6d尾靜脈注射50 mg/kg LPS。
　　(2)模型的評價:通過觀察小鼠7d

7、死亡率;血清TNF-α及IL-6釋放水平;小鼠對大腸埃希菌敏感性變化;小鼠血液中細菌數量的變化評價模型。
　　2.小鼠內毒素耐受模型的優(yōu)化與評價
　　(1)模型的優(yōu)化:通過連續(xù)腹腔注射不同次數及不同劑量的LPS后，再尾靜脈注射50 mg/kg LPS，通過觀察小鼠體重及狀態(tài)變化確定最佳耐受模型的建立方案。
　　(2)模型的評價:通過觀察小鼠7d死亡率;血清、肺及脾TNF-α、IL-6及IL-1β釋放水平的變化;小鼠對銅

8、綠假單胞菌敏感性變化評價模型。
　　1.細胞因子檢測:采用ELISA法測定青蒿琥酯對內毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾TNF-α、IL-6及IL-1β釋放的影響。
　　2.死亡率觀察:通過統計小鼠7d死亡率，觀察青蒿琥酯對內毒素耐受二次打擊模型小鼠死亡率的影響。
　　3.細菌清除能力研究:采用平板計數法觀察青蒿琥酯對內毒素耐受二次打擊模型小鼠血液、肺和脾中細菌數量變化的影響。
　　三、青蒿琥酯對內毒素耐受模型小鼠保護

9、作用機制的初步研究
　　1.體外研究
　　(1)內毒素耐受細胞模型的建立與評價:RAW264.7細胞加入5 ng/mL LPS預處理4h后再加入100 ng/mL LPS;采用ELISA法檢測上清TNF-α及IL-6釋放水平。
　　(2)細胞因子檢測及信號轉導分子檢測:采用ELISA法分別檢測青蒿琥酯對內毒素耐受模型細胞釋放TNF-α及IL-6的影響及其對NF-κB p65及p50活化的影響;采用免疫熒光技術檢測青蒿琥

10、酯對內毒素耐受模型細胞TLR4、TRAF6表達的影響。
　　(3)細菌清除能力研究:內毒素耐受細胞加入5.0×106 CFU/mL銅綠假單胞菌建立內毒素耐受二次打擊細胞模型;平板計數法觀察青蒿琥酯對內毒素耐受二次打擊模型細胞細菌數量變化。
　　2.體內研究
　　采用免疫組織化學技術檢測青蒿琥酯對內毒素耐受模型小鼠肺和脾中重要信號分子TLR4、TRAF6蛋白表達及NF-κB p65蛋白活化的影響。
　　結果:

11、>　　一、小鼠內毒素耐受模型的建立與評價
　　1.小鼠內毒素耐受模型的初步建立與評價
　　采用腹腔連續(xù)5d注射1 mg/kg LPS并于第6d尾靜脈注射50 mg/kg LPS，7d內小鼠全部存活，表明模型建立基本成功;
　　耐受模型小鼠血清TNF-α及IL-6水平較50 mg/kg LPS攻擊小鼠明顯減少;導致耐受小鼠100％死亡的最低大腸埃希菌數量較正常小鼠明顯減少;細菌攻擊耐受小鼠血液中EC數量較單獨細菌攻擊小鼠

12、明顯增多。
　　2.小鼠內毒素耐受模型的優(yōu)化與評價
　　(1)腹腔注射0.3、1.0及3.0 mg/kg LPS預處理劑量僅0.3 mg/kg LPS預處理3或5d后小鼠體重及狀態(tài)基本恢復，因此確定最佳建模方案為:腹腔連續(xù)3d注射0.3 mg/kg LPS后于第4d尾靜脈注射50 mg/kg LPS。
　　(2)耐受模型小鼠7d內全部存活;耐受模型小鼠血清、肺和脾TNF-α、IL-6及IL-1β水平較50 mg/kg

13、LPS攻擊小鼠明顯減少;導致耐受模型小鼠100％死亡的最低銅綠假單胞菌劑量較正常小鼠明顯減少。
　　二、青蒿琥酯對內毒素耐受及二次打擊模型小鼠的保護作用
　　1.青蒿琥酯呈劑量依賴性地增加內毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾中TNF-α、IL-6及IL-1β的釋放。
　　2.青蒿琥酯呈劑量依賴性地降低內毒素耐受二次打擊模型小鼠的7d死亡率。
　　3.青蒿琥酯顯著減少內毒素耐受二次打擊模型小鼠血液、肺和脾中銅綠假單胞菌數

14、量。
　　三、青蒿琥酯對內毒素耐受模型小鼠保護作用機制的初步研究
　　1.體外研究
　　(1)采用5 ng/mL LPS預處理4h后再用100 ng/mL LPS處理細胞建立內毒素耐受模型，模型細胞TNF-α及IL-6釋放較100 ng/mL LPS處理組細胞明顯減少。
　　(2)青蒿琥酯呈濃度依賴性地增加內毒素耐受模型細胞TNF-α及IL-6的釋放;AS可增加內毒素耐受模型細胞中TLR4、TRAF6蛋白表達及N

15、F-κB p65蛋白活化;
　　(3)青蒿琥酯顯著減少內毒素耐受二次打擊模型細胞內銅綠假單胞菌數量。
　　2.體內研究
　　青蒿琥酯可增加內毒素耐受模型小鼠肺和脾中TLR4、TRAF6蛋白表達及NF-κB p65蛋白活化。
　　結論:
　　1.采用腹腔連續(xù)3d注射0.3 mg/kg的LPS并于第4d尾靜脈注射50 mg/kg的LPS能成功建立LPS耐受小鼠模型，該模型穩(wěn)定性好、重復性高，且造模周期最短、藥品

16、消耗最少。
　　2.青蒿琥酯可顯著提高內毒素耐受模型小鼠致炎細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β的釋放;青蒿琥酯對內毒素耐受二次打擊模型小鼠具有顯著的保護作用，可提高內毒素耐受二次打擊模型小鼠對銅綠假單胞菌的清除能力。
　　3.青蒿琥酯可顯著提高內毒素耐受模型細胞致炎細胞因子TNF-α及IL-6的釋放;青蒿琥酯可提高內毒素耐受二次打擊模型細胞對銅綠假單胞菌的清除能力。
　　4.青蒿琥酯對內毒素耐受二次打擊模型小鼠的