白頭翁質量評價與五環(huán)三萜皂苷類成分的藥物代謝動力學研究.pdf

1、白頭翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)是毛茛科植物白頭翁的干燥根[3]，主要分布于亞洲、歐洲和北美洲等地區(qū)。白頭翁具有清熱解毒、涼血止痢的功效，臨床上被廣泛用于阿米巴性痢疾、瘧疾、陰道滴蟲、細菌感染和惡性腫瘤等疾病的治療。近年來，由于白頭翁藥材具有明顯的抗腫瘤[6-11]作用而越來越被廣泛關注。故本課題對白頭翁藥材進行了系統(tǒng)地分離、質量評價和藥物代謝動力學研究。
　　本實驗采用大孔吸附樹脂法，硅

2、膠柱色譜法、葡聚糖凝膠和反相柱色譜法對白頭翁藥材進行系統(tǒng)分離，并建立了一個簡單、快速的HPLC-ESI-MS法同時定量測定白頭翁藥材中9種化學成分。在對其進行定性研究中，利用HPLC-ESI-MS/MS聯用技術分析研究了8個五環(huán)三萜皂苷類化合物的特征碎片離子，推測其電噴霧質譜裂解規(guī)律，最終在白頭翁提取物中推導出了37個五環(huán)三萜皂苷化合物的結構。在藥代動力學研究中，首次建立了一種靈敏的、可靠的多次切換監(jiān)測模式HPLC-MS方法同時測定大鼠

3、灌胃給予白頭翁提取物后大鼠血漿中4種三萜皂苷的含量，并應用于藥代動力學研究。首次對大鼠口服白頭翁提取物后膽汁中6種五環(huán)三萜皂苷類化合物進行分析測定，并對這些三萜皂苷的膽汁排泄輪廓進行研究。綜上對白頭翁藥材的系統(tǒng)研究將為其進一步開發(fā)應用提供全面的理論依據。
　　第一部分白頭翁化學成分研究
　　目的：研究藥材白頭翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)中的化學成分。
　　方法：取粉碎后的白頭翁

4、約10 kg，用70％乙醇冷浸提取3次，采用AB-8大孔吸附樹脂進行分離，收集70％乙醇洗脫液部分，得浸膏(總苷)約500 g。采用大孔吸附樹脂法，硅膠柱色譜法、葡聚糖凝膠和反相柱色譜法對白頭翁藥材進行系統(tǒng)分離，并用波譜和化學方法鑒定化合物的結構。
　　結果：從白頭翁的70％乙醇提取物中分離得到9個單體化合物，對其進行了結構鑒定，其中包括5個五環(huán)三萜皂苷，2個三萜酸，2個甾酮類化合物。分別鑒定為齊墩果酸、白頭翁皂苷A3、白頭翁皂苷

5、B4、23-羥基白樺脂酸、刺人參皂苷S、白頭翁皂苷B、白頭翁皂苷C、筋骨草甾酮C和β-蛻皮甾酮。
　　結論：從白頭翁中分離鑒定了9個化合物，其中3個化合物為首次從該植物中發(fā)現，分別為刺人參皂苷S，筋骨草甾酮C和β-蛻皮甾酮。
　　第二部分液質聯用技術同時測定白頭翁中9種化學成分及其質量表征
　　目的：建立HPLC-MS法測定白頭翁中白頭翁皂苷B4(1)，白頭翁皂苷A3(2)，23-羥基白樺脂酸(3)，刺人參苷S(4)，

6、白頭翁皂苷C(5)，白頭翁皂苷B(6)，齊墩果酸(7)，β-蛻皮甾酮(8)和筋骨草甾酮C(9)含量的方法。
　　方法：采用Sapphire C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：A(甲醇含0.1％甲酸)-B(0.1％甲酸水溶液)，梯度洗脫程序為0-6 min(75％-95％A)，6-14 min(95％A)，隨后回到最初75％A并持續(xù)到21 min；流速為0.8 mL·min-1。采用電噴霧離子源進行正離子和負離子模

7、式檢測，多反應監(jiān)測模式(MRM)用于定量測定。正離子監(jiān)測模式下源噴射電壓設置為5500 V；負離子監(jiān)測模式下源噴射電壓設置為-4500 V；離子源溫度為650℃。霧化氣(Gasl)：40 psi，加熱氣(Gas2)：50 psi，接口持續(xù)加熱，簾氣25 psi，全程氮氣通入狀態(tài)。掃描方式采用多重反應監(jiān)測(MRM)；碰撞氣(CAD，N2)壓力為medium；Q1和Q3分辨率均為UNIT。
　　結果：峰面積與濃度呈良好的線性關系(r2

8、>0.9948)；日內和日間精密度分別小于2.78％和2.68％，并應用于20批次不同來源白頭翁藥材的含量測定。
　　結論：本研究中建立的分析方法靈敏度高、專屬性好，可為白頭翁藥材質量控制提供一個強有力的工具。有助于規(guī)范白頭翁藥材的質量，并能夠在一定程度上指導中醫(yī)臨床用藥的合理性。
　　第三部分液質聯用技術定性鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類成分
　　目的：對白頭翁進行超聲提取后即進行HPLC-MS分析，研究8個五環(huán)三萜皂苷

9、類化合物的特征碎片離子，推測其電噴霧質譜裂解規(guī)律，再將此規(guī)律應用于白頭翁中未知羽扇豆烷型和齊墩果烷型三萜皂苷類化合物的結構推測，根據已知裂解規(guī)律盡可能多的推測出白頭翁中五環(huán)三萜皂苷的化學結構。
　　方法：采用了MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI兩種模式分析未知五環(huán)三萜皂苷類化合物。取白頭翁藥材粉末(40目)5 g，加70％甲醇25 mL，稱重，冰浴超聲提取1 h，稱重，用70％甲醇補足減失的重量，0.45μm微孔濾膜

10、濾過，濾液減壓蒸干，殘渣用2 mL的70％甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜濾過，進行HPLC-MS分析。色譜柱為Sapphire C18(250 mm×4.6mm，5μm)，采用0.1％甲酸甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)為流動相，梯度洗脫75-75％A(0-15 min)；75-80％A(15-30 min)；80-95％A(30-40min)；95-95％A(40-50 min)，流速為700μL·min-1。質譜：ESI源；負離子檢

11、測源電壓-4500 V；正離子檢測源電壓5500 V；源溫度(TEM)：650℃；霧化氣(gas1)：40 psi，加熱氣(gas2)：50 psi，簾氣(CUR)：25 psi。
　　結果：通過與對照品的保留時間、分子量和質譜數據比較，分別對8個已知五環(huán)三萜化合物色譜峰進行歸屬?；衔?，10，14，18，20，21，35和36分別鑒定為白頭翁皂苷B4，白頭翁皂苷C，23-羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[吡喃鼠

12、李糖基-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]，白頭翁皂苷B，23-羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[吡喃阿拉伯糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]，常春藤皂苷元28-O-[吡喃葡萄糖基.吡喃葡萄糖酯苷]，白頭翁皂苷A3和常春藤皂苷。同時，通過由對照品裂解行為總結得出的規(guī)律推斷出了29個五環(huán)三萜皂苷類化合物的結構。
　　結論：本實驗首次建立了利用HPLC-ESI-MS聯用技術分析白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類成分的

13、方法。本法靈敏度高、專屬性強，成功用于白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化合物的結構鑒定。通過聯合MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI掃描模式對化合物結構分析方面具有明顯優(yōu)越性，對控制中藥材質量具有重要意義。
　　第四部分 HPLC-MS法同時測定大鼠血漿中4種五環(huán)三萜皂苷類成分及其藥物代謝動力學研究
　　目的：建立HPLC-MS/MS同時測定大鼠血漿中白頭翁提取物4個五環(huán)三萜皂苷類化合物(白頭翁皂苷B4，白頭翁皂苷B，白頭

14、翁皂苷A3和23-羥基白樺脂酸)的分析方法，并計算其在大鼠體內的藥動學參數。
　　方法：血漿樣品采用了Strata-X固相萃取柱預處理，采用Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱；以A(甲醇含0.1％甲酸)-B(0.1％甲酸水溶液)為流動相，梯度洗脫程序為：0-6 min，75-95% A；6-15 min，保持95%A不變，預平衡時間為6 min，流速為800μL·min-1。色譜柱后溶液全部進入離

15、子源，無分流，分析時間為15 min。質譜以電噴霧離子源進行正離子模式和負離子模式檢測，采用多反應監(jiān)測模式，并首次應用了多次切換檢測模式。白頭翁皂苷B4，白頭翁皂苷B，白頭翁皂苷A3，23-羥基白樺脂酸和內標的監(jiān)測離子對分別為m/z1219.7/749.4，m/z819.4/347.2，m/z749.6/471.2，m/z471.4/471.4和m/z461.1/285.0。本研究將4種五環(huán)三萜皂苷類成分和內標化合物的檢測過程劃分為5個

16、階段：0.0-6.998 min，內標和白頭翁皂苷B4在負離子模式下監(jiān)測；6.998-7.028min，負離子掃描模式被切換至正離子掃描模式；7.028-10.027 min，正離子模式下監(jiān)測白頭翁皂苷B；10.027-10.057 min，正離子掃描模式被切換至負離子掃描模式；10.057-15.059min，負離子模式下監(jiān)測白頭翁皂苷A3和23-羥基白樺脂酸。
　　結果：4種五環(huán)三萜皂苷類成分在大鼠血漿中專屬性、線性、準確度、

17、精密度、提取回收率和基質回收率均被驗證。4種待測化合物的線性關系良好(r2>0.99)；日內、日間精密度的相對標準偏差(RSD)均小于9%；在室溫儲存24 h，5次凍融和-20℃儲存30天的條件下各待測化合物的穩(wěn)定性良好，準確度在-6.82%-6.18%之間；高、中、低三個濃度水平的平均提取回收率分別為82.16%-104.5%；基質效應均值在77.69%-108.2%之間。
　　結論：該方法特異、快速、靈敏，結合固相萃取的預處理

18、方法和HPLC-MS的新檢測手段對白頭翁中4種五環(huán)三萜皂苷類化合物進行了藥物代謝動力學研究。本研究中首次應用了多次切換檢測模式，并首次在五環(huán)三萜皂苷類化合物體內測定時采用了Strata-X固相小柱進行生物樣品預處理。此方法為五環(huán)三萜皂苷類化合物的藥物代謝動力學研究提供了一個新的思路。
　　第五部分液質聯用技術測定大鼠膽汁中6種五環(huán)三萜皂苷類成分及其排泄動力學研究
　　目的：建立一種可同時測定大鼠膽汁中6種主要五環(huán)三萜皂苷類化

19、合物(白頭翁皂苷B4，刺人參苷S，白頭翁皂苷C，白頭翁皂苷B，白頭翁皂苷A3和23-羥基白樺脂酸)含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予白頭翁提取物后其6種待測化合物的膽汁排泄動力學研究。
　　方法：色譜柱為Sapphire-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫為25℃：流動相為(0.1%甲酸)甲醇A-0.1%甲酸水溶液B，梯度洗脫，洗脫程序如下：0.0-6.0 min，75-95% A；6.0-15.0 m

20、in，保持95% A；進樣前預平衡6 min。流速為800μL·min-1。色譜柱后溶液全部進入離子源，無分流，進樣量為10μL。電噴霧離子源(ESI源)，Turbo V離子源，源溫度為650℃。源噴射電壓為5500 V和-4500 V，源內氣體1(Gasl，N2)壓力：40 psi；氣體2(Gas2，N2)壓力：50psi；氣簾氣體(N2)壓力：25 psi；正負離子分別檢測模式；掃描方式為多重反應監(jiān)測(MRM)；碰撞氣(CAD，N2

21、)壓力為medium；Q1分辨率為UNIT，Q3分辨率為UNIT。SD大鼠8只，隨機分成2組。其中2只為空白對照組，實驗組6只大鼠灌胃給予白頭翁提取物(10 mL·kg-1)后，收集給藥后0-1 h，1-3 h，3-5 h，5-7 h，7-9 h，9-12 h和12-24 h時間段的膽汁并測定體積。測定大鼠灌胃給予白頭翁提取物后膽汁中6種五環(huán)三萜皂苷類化合物的累積排泄率。
　　結果：大鼠膽汁中內源性物質不干擾6種待測化合物和內標的

22、測定；6種五環(huán)三萜皂苷類成分標準曲線的相關系數(r2)均大于0.9973；日內RSD和日間RSD分別小于9.1%和9.0%，RE在-9.5%到9.2%之間；提取回收率的范圍為80.03%～115.6%；基質效應的范圍為78.43%～109.7%。
　　結論：該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性強，可滿足大鼠膽汁中微量五環(huán)三萜類皂苷成分的測定要求。待測6種五環(huán)三萜皂苷類化合物在1～3 h內排泄率最高，在3～5 h時間段時略有減少，隨著

23、時間的推移，排泄率逐漸降低，并趨于平緩。結果表明，只有不到14%的待測物以原型從膽汁排泄，結果表明其五環(huán)三萜皂苷類化合物在體內可能存在某種生物轉化和體內代謝。
　　第六部分白樺脂酸血漿蛋白結合率測定
　　目的：建立白樺脂酸在大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白中蛋白結合率的測定方法。
　　方法：采用平衡透析法測定白樺脂酸血漿蛋白結合率，利用HPLC法測定血漿中白樺脂酸濃度，測定并比較不同血漿中白樺脂酸的血漿蛋白結合率。

24、>　　結果：在50～100μg/mL，藥物濃度對血漿蛋白結合率無顯著影響，白樺脂酸與大鼠和人的血漿蛋白結合率存在顯著性差異，白樺脂酸與人血漿蛋白結合率高于與大鼠血漿蛋白結合率。
　　結論：白樺脂酸與血漿蛋白具有較強的結合，且在實驗設計的濃度范圍內蛋白結合率與透析液中藥物濃度無關。只有少量游離藥物作為活性藥物分子參與體內藥物處置，從而產生藥理效應。
　　第七部分白樺脂酸大鼠在體腸吸收動力學研究
　　目的：建立同時測定腸循

25、環(huán)液中白樺脂酸和酚紅濃度的HPLC-DAD法，并探討白樺脂酸在大鼠各腸段的吸收動力學特征及不同藥物濃度對吸收的影響。
　　方法：采用大鼠在體腸吸收實驗模型，并考察吸收部位、藥物濃度和pH值對藥物吸收的影響。色譜柱為Diamonsil ODS C18色譜柱(250mm×4.6 mm，5μm)；流動相為乙腈-0.2%乙酸(75:25)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長203 nm(白樺脂酸)和430 nm(酚紅)；進

26、樣量20μL。
　　結果：在75～125μg·mL-1內白樺脂酸的吸收速率與質量濃度呈線性關系，Ka值基本保持不變；各腸段的吸收速率無顯著性差異，十二指腸、空腸、回腸和結腸的Ka值分別為(0.151±0.0049)，(0.156±0.0056)，(0.149±0.0083)，(0.159±0.0041)h-1。
　　結論：白樺脂酸在小腸中吸收良好，沒有特定吸收部位；不同濃度對白樺脂酸在大鼠全腸道的吸收無顯著影響，其在腸道的吸