玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及功能驗證.pdf

1、熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)具有豐富的遺傳變異性,對其改良和利用是拓寬我國種質(zhì)資源的有效途徑。然而,影響其在溫帶地區(qū)利用的最主要限制因素就是光周期敏感性。因此,分離、克隆玉米光周期敏感相關(guān)基因并探知其功能,從分子水平揭示玉米光周期敏感現(xiàn)象、鈍化光周期敏感性,對熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)的有效利用具有重要的理論和實踐意義。本研究以熱帶玉米自交系CML288和溫帶玉米自交系黃早4為材料,利用同源克隆的方法克隆了與擬南芥ELF4、水稻OsELF4基因同源的

2、玉米ZmELF4基因；利用熒光定量PCR技術(shù),研究了不同材料相同光照、同一材料不同光照、不同組織、不同的發(fā)育階段以及其在非光周期條件下ZmELF4基因的表達規(guī)律,分析了ZmELF4基因與ZmCOL和ZmCCA1的關(guān)系；構(gòu)建了ZmELF4基因的融合表達載體及過量表達載體,并分別通過洋蔥表皮瞬時表達實驗進行了亞細胞定位研究,通過農(nóng)桿菌介導花序侵染法進行了過量表達轉(zhuǎn)基因功能驗證。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用基因同源克隆技術(shù),首次

3、克隆了玉米的ZmELF4基因,GenBank登錄號為HQ009862。該基因序列中不存在內(nèi)含子,但是在5’非編碼區(qū)DNA序列中有一段約169bp的插入序列,而cDNA序列中沒有該段序列。獲得的cDNA序列全長約680bp,含有432bp的開放性閱讀框,推測其編碼一條含有144個氨基酸的肽鏈。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),ZmELF4與水稻OsELF4位于同一進化分枝,其親緣關(guān)系最近。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其含有保守的未知功能的DUF1313結(jié)構(gòu)域,推測

4、其是ELF4,/OsELF4的同源基因。
　　 2.應(yīng)用實時熒光定量PCR研究了ZmELF4基因在CML288和黃早4中,在長短日照兩種處理條件下的晝夜節(jié)律表達規(guī)律及其在不同組織、不同的發(fā)育階段的表達規(guī)律,分析了ZmELF4基因與擬南芥CCA1和CO在玉米中的同源基因ZmCCA1、ZmCOL的表達關(guān)系。結(jié)果表明,無論是CML288還是黃早4,長短日照條件下,在葉片與莖尖中ZmELF4基因的表達都呈現(xiàn)出節(jié)律性,當把植株挪移到連續(xù)光

5、照條件下后這個節(jié)律仍然不變,只是表達的振幅逐漸降低而已,并且兩種材料在相應(yīng)的長短日照條件下表達高峰時期一致,只是整體表達量不同；在玉米的不同發(fā)育階段、不同組織ZmELF4也都表達,但是兩種材料中的表達又明顯存在差異；此外,將ZmELF4的表達規(guī)律與ZmCCA1和ZmCOL的表達規(guī)律相比較發(fā)現(xiàn),它們之間存在密切的關(guān)系,并且ZmELF4與ZmCOL的表達高峰都處在光周期誘導開花的敏感時期內(nèi),推測ZmELF4可能與兩者相互作用,通過某種途徑共

6、同調(diào)控玉米光周期誘導開花的過程。
　　 3.利用基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了帶有GFP標記的融合表達載體pGIT-ZmELF4-GFP和能夠高效表達的過量表達載體pBI—ZmELF4,通過洋蔥表皮瞬時表達實驗對ZmELF4進行了亞細胞定位研究,結(jié)果將其定位于細胞核；通過農(nóng)桿菌介導花序侵染法將過量表達載體pBI—ZmELF4導入擬南芥進行間接功能驗證,獲得了7株陽性轉(zhuǎn)化苗,且轉(zhuǎn)化苗的開花期平均比野生型擬南芥推遲了25天左右,葉片數(shù)也比