纖溶酶原激活物抑制劑-1對大鼠胚肺成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中最常見的一種類型，約占47%～71%，其預(yù)后差，生存中位時(shí)間僅為3至4年。IPF主要病理特征為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜的損害，并伴有嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，同時(shí)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞異常增生，膠原過度沉積。IPF的基本病因目前還不清楚，在以往的研究中多認(rèn)為與多種細(xì)胞因子參與的

2、炎癥和纖維化過程有關(guān)，如：轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血小板源性生長因子(PDGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP等。
　　纖溶酶原激活物抑制劑-1(Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的主要作用是抑制尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogenactivator，uPA)和組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tissue-type pl

3、asminogenactivators，tPA)，它與u-PA或t-PA形成1:1復(fù)合物，滅活纖溶酶原。目前研究認(rèn)為，在肺纖維化的發(fā)展過程中，PAI-1調(diào)節(jié)體內(nèi)多種細(xì)胞如白細(xì)胞、纖維母細(xì)胞的黏附和移行，進(jìn)入損傷組織，并與多種細(xì)胞因子TGF-β、TNF-α、PDGF等相互作用，進(jìn)一步上調(diào)自己的表達(dá)，使PAI-1大量分泌，活性升高，u-PA活性降低，纖溶系統(tǒng)受到損害，不能完全清除已形成的纖維蛋白，從而加速肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。雖然IPF潛在的

4、發(fā)展機(jī)制不清楚，最新的證據(jù)表明，增加PAI-1的表達(dá)對IPF發(fā)病機(jī)制有很重要貢獻(xiàn)。博萊霉素(Bleomycin，BLM)致肺纖維化的轉(zhuǎn)基因大鼠模型證實(shí)了肺纖維化的程度與PAI-1的基因密度呈明顯正相關(guān)。目前，已有應(yīng)用siRNA技術(shù)沉默PAI-1表達(dá)減輕肝纖維化的報(bào)道。
　　體外研究表明，PAI-1可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞增殖，并抑制其凋亡。本研究中，為了探討PAl-1在肺纖維化發(fā)生中的作用，我們將體外培養(yǎng)的大鼠胚肺成纖維

5、細(xì)胞加入外源性PAI-1，觀察成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、膠原合成的變化。進(jìn)一步通過TNF-α誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡后，觀察PAI-1對體外培養(yǎng)的大鼠胚肺成纖維細(xì)胞自發(fā)及誘導(dǎo)凋亡的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　1外源性PAI-1對成纖維細(xì)胞增殖的影響及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
　　將凍存的大鼠胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后，分為以下三組：Control組、PAI-1組和TGF-β組。在培養(yǎng)液中分別加入相應(yīng)的物質(zhì)使其濃度分別達(dá)到20 ng/ml(PAI

6、-1)和2 ng/ml(TGF-β)。我們前期研究結(jié)果表明，這一濃度促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖最明顯。應(yīng)用western blotting法分別測定24 h、48h和72 h PAI-1、α-SMA、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR和Real time PCR分別測定24 h的PAI-1、α-SMA、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察24 h、48 h細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化。

7、>　　2外源性PAI-1對成纖維細(xì)胞凋亡的影響及信號通路
　　將凍存的大鼠胚肺成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后，分為以下四組：Control組、PAI-1組、TNF-α+anti-Fas組和TNF-α+anti-Fas+PAI-1組。在培養(yǎng)液中分別加入相應(yīng)的物質(zhì)，使其在培養(yǎng)液中達(dá)到如下濃度：PAI-1:20 ng/ml；TNF-α：20 ng/ml；anti-Fas：1μg/ml，應(yīng)用western blotting法測PAI-1、Caspase

8、-3、NF-κB、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)程序(StatisticalProgrom for Social Sciences13.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察組與對照組的樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較組間差異，有顯著差異者用最小顯著差法(least significant differenc

9、e，LSD)進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1復(fù)蘇后的成纖維細(xì)胞呈圓球形，約4-5小時(shí)即貼壁、開始伸展，完全伸展的細(xì)胞形狀如梭形，細(xì)胞透亮，連接緊密，逐漸生長呈放射狀，互相連接，復(fù)蘇成功的細(xì)胞為第2代，實(shí)驗(yàn)用第3-5代。
　　2經(jīng)過外源性PAI-1刺激后，可以使成纖維細(xì)胞內(nèi)PAI-1在24 h高表達(dá)，并持續(xù)到72 h。同時(shí)，使成纖維細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)Ca2

10、+濃度、磷酸化ERK、AKT的表達(dá)增加(P<0.05)。PAI-1的上述作用與TGF-β作用相似。
　　3外源性PAI-1使Caspase-3表達(dá)下調(diào)并抑制經(jīng)TNF-α致敏、anti-Fas誘導(dǎo)的Caspase-3表達(dá)上調(diào)，同時(shí)上調(diào)NF-κB、磷酸化ERK和AKT蛋白的表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1 PAI-1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和合成膠原，這些作用可能與PAI-1增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，活化AKT