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文檔簡介
1、鋅指蛋白ZNF265(ZNF265,Zfp265,zis)于1997年由Karginova等人從大鼠的JG細胞(renaljuxtaglomerular)中克隆到[1]。JG細胞是位于腎動脈和腎小球緊密連接處的一類特化的肌內皮細胞,其主要功能是合成,分泌與儲存腎素(renin)。作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中的重要活性物質,腎素對于血管內血壓及鹽離子濃度的維持十分重要,然而關于JG細胞維持分化狀態(tài)分泌腎素的分子機制卻鮮有報導。ZN
2、F265的mRNA存在于分化狀態(tài)的具有分泌腎素功能的JG細胞中,但在非分化狀態(tài)并且無分泌腎素功能的JG細胞中其表達消失。因此,ZNF265可能與JG細胞的分化狀態(tài)和腎素分泌的功能相關[1-3]。對ZNF265編碼的序列分析表明,ZNF265具有兩個新型的鋅指結構,一個Ser-Are(SR)富集區(qū),一個谷氨酸富集區(qū)和一個核定位信號(NLS)(圖1),這些特征可能與前體mRNA剪接或成熟mRNA結合相關[4]。2001年,Adams等人的研
3、究發(fā)現(xiàn),隨著轉染到細胞內的ZNF265表達質粒濃度的遞增,ZNF265可以促使Tra-2β1前體mRNA第二、三個外顯子的選擇性剔除,導致截短型Tra-2β3剪接體增加[5]。因此,ZNF265可能是一個參與選擇性剪接的多功能蛋白,包括通過直接調節(jié)腎素前體mRNA的后加工過程或者通過對其他基因的調控間接影響JG細胞分化狀態(tài)。 Fig.1 Amino acid sequence of ZNF265-1 and box diagra
4、m of motifs and domains本文的主要目的是檢測ZNF265在細胞、組織中的表達及ZNF265在具有局部腎素-血管緊張素的組織中的表達調控,研究ZNF265對于腎素及其它相關基因前體mRNA剪接影響并探索ZNF265在JG細胞的去分化過程中的功能。 首先我們通過RT-PCR等方法分析了ZNF265在人及小鼠各個組織中的表達譜,在小鼠的組織里,發(fā)現(xiàn)并克隆了ZNF265的一個新的亞型mZNF265-2,它在人體當中
5、具有高度同源的對應體hZNF265-2。對ZNY265在不同組織的表達量的分析表明,ZNF265的兩個亞型在人體及小鼠的各個組織當中均有表達,在20周的人胎組織中,ZNF265-1及ZNF265-2普遍表達,但表達水平隨組織不同而有差異,如在大腦、小腦和肝組織中,兩個亞型的轉錄體表達量基本相當(ZNF265-1/ZNF265-2的比值在0.9~1.1之間)。在心、肺、腸組織中,ZNF265-2的表達明顯高于ZNF265-1的表達(ZNF
6、265-1/ZNF265-2的比值在0.45~0.7之間);而在腎組織中,ZNF265-1的表達明顯高于ZNF265-2的表達(ZNF265-1/ZNF265.2的比值為1.48)。相比之下,在小鼠的各個組織當中都以ZNF265-1的表達方式為主,且ZNF265-1相對與ZNF265-2的表達比例差異不大,大體為4:1左右。實驗結果提示,ZNF265 mRNA的表達與所在組織的特異性密切相關,相對于小鼠,ZNF265 mRNA在人體當中
7、的表達可能受到更復雜的調控。 為了分析ZNF265在人及小鼠不同組織中的蛋白表達,我們首先針對ZNF265及其兩個亞型制備了特異的抗血清并通過ELISA、GST融合蛋白原核表達等實驗鑒定這些抗血清的特異性。Western blot結果顯示,ZNF265-1蛋白在受檢的人及小鼠各個組織中均有表達,并且在小鼠不同發(fā)育階段具有不同的表達特征:初生小鼠各個組織ZNF265蛋白表達差異較小,而在成年小鼠中,ZNF265在腎、肺和心肌組織中
8、表達量較高,在腦、肝等組織中的表達量較低。此外,在受檢的人胎兒及小鼠組織中,我們沒有檢測到ZNF265-2蛋白的表達。實驗結果說明,在人類及小鼠組織中以ZNF265-1蛋白表達為主,ZNF265-2可能僅作為轉錄體存在并不表達蛋白,或表達量低于可檢測范圍。 作為一個參與選擇性剪接的SR相關蛋白,ZNF265主要功能場所應該在細胞核內。用制備的兔抗ZNF265抗血清及Histag抗體,我們檢測了內源性ZNF265蛋白及過表達ZNF
9、265融合Histag蛋白在細胞內的表達,并觀察了GFP融合ZNF265蛋白在COS1細胞內的表達分布。以上實驗結果均表明,ZNF265主要在細胞核內分布,也驗證了我們制備的兔抗ZNF265抗血清能用于免疫組化的檢測。 由于ZNF265可能與腎素分泌相關,本文檢測了ZNF265在具有局部腎素-血管緊張素的小鼠生殖系統(tǒng)內的表達分布及所受調控。通過免疫組織化學、精子免疫細胞化學等的方法對ZNF265在生殖系統(tǒng)中的分布進行檢測,研究結
10、果表明,ZNF265蛋白特異性地分布在雌鼠卵巢的透明帶,黃體和髓質細胞的核內,雄鼠精子尾部的中段和附睪主細胞近腔面的緊密連接處。這些分布與腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的血管緊張素Ⅱ的表達分布具有相似性[6-8]。另外,以正常小鼠為對照,在去勢小鼠內的附睪中,ZNF265表達大大降低,而補加了睪酮后,ZNF265的表達恢復到正常水平。這一調控現(xiàn)象,和已報道的血管緊張素及其受體在附睪內的調控表達具有類似性[9]。研究結果提示,ZNF265可能參與
11、了對腎素-血管緊張素系統(tǒng)中相關基因的調節(jié),此可能性尚有待進一步研究。 相關報導表明,腎素在人體內有多個選擇性剪接產物,分別為分泌型的腎型(Renin a)和不分泌型的腦型(Renin b)及肺型(Renin c)成熟轉錄體[10,11]。作為前體mRNA的選擇性剪接蛋白ZNF265,有可能通過對腎素前體mRNA的選擇性剪接調控而參與調節(jié)腎素表達。因此我們構建了腎素小基因(Renin Exon1-3)用于研究ZNF265是否對其具
12、有選擇性剪接的功能。其中外顯子Renin Exon1a和Renin Exon1c的選擇性剪接為二者取一的模式,分別只存在于腎型和肺型的成熟轉錄體中。通過對腎素小基因剪接模型的研究表明,腎素小基因在體內的選擇性剪接模式和細胞類型相關,ZNF265過量表達對腎素前體mRNA剪接模式沒有影響。說明腎素的表達具有復雜的調控機制,與決定細胞類型的多種蛋白的綜合作用相關。 考慮到ZNF265在體內各個組織中均有表達,可能具有廣泛作用。本文還
13、構建了FGF-2R、GluR-B、hZis、mZis等小基因,并研究了ZNF265對SMN2、CFTR等疾病相關基因的選擇性剪接的影響,其中FGF-2R、GluR-B為神經系統(tǒng)特異表達基因;SMN2和CFTR在體內廣泛表達,SMN2外顯子7的選擇性剃除與脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)臨床表型的嚴重程度密切相關,CFTR的成熟轉錄體缺少Exon9會引起先天性雙側輸精管缺失(Congenital b
14、ilateral absence of the vas deferens,CBAVD);hZis、mZis小基因則包含了人或小鼠ZNF265的9~11外顯子的基因組DNA片段,用于研究ZNF265的自調控功能。研究結果表明,ZNF265的過量表達對于FGF-2R前體mRNA剪接沒有明顯影響。對于GluR-B、SMN2、CFTR等小基因,ZNF265的過量表達分別能促進GluR-B外顯子14、SMN2外顯子7和CFFR外顯子9的選擇性剃除
15、,即促進它們的前體mRNA的截短型剪接并且這些截短型剪接產物的比例增加為ZNF265蛋白濃度依賴型。此外,我們的研究發(fā)現(xiàn),ZNF265-2的過量表達可改變對hZis、mZis小基因的剪接方式,提示該剪接蛋白可能參與對自身前體mRNA的剪接調控。 鑒于ZNF265具有典型的RNA結合結構域,以前的研究認為ZNF265可能與成熟mRNA結合。若ZNF265和JG細胞分化狀態(tài)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關基因有表達調控的關系的話,ZNF
16、265有可能通過與目標基因的mRNA結合調控目標基因的表達。鑒于諸多研究表明細胞周期蛋白調節(jié)因子和細胞分化狀態(tài)有密切關系,本文用免疫共沉淀結合RT-PCR的方法不僅篩選了與ZNF265蛋白可能相結合的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關基因的mRNA還篩選了與ZNF265蛋白可能相結合的多種細胞周期蛋白調節(jié)因子的mRNA。我們的研究表明,雖然ZNF265蛋白與腎素-血管緊張素系統(tǒng)的相關基因的mRNA沒有直接結合的關系,但和細胞周期蛋白調節(jié)因子Cy
17、clin B1、Cyclin D2的mRNA具有明顯的結合關系,提示ZNF265對于細胞周期蛋白調節(jié)因子B1、D2的表達有調控關系。有證據(jù)表明,ZNF265蛋白家族的C4SR(爪蟾源)及Zfp265(大鼠源)在體外能和Cyclin B1轉錄體結合,這與我們的研究結果是一致的。細胞周期調節(jié)蛋白Cyclin B1和Cyclin D2與細胞的生長及分裂密切相關,在很多癌細胞和去分化細胞中都會過表達[12-16]。因此ZNF265很可能通過參與
18、對這些細胞周期調節(jié)蛋白mRNA穩(wěn)定性或后加工等過程的調節(jié)而影響了JG細胞的去分化過程。 綜上所述,本論文圍繞ZNF265在前體mRNA剪接中的功能和機制這一大方向,進行了初步的探索,對ZNF265的亞型,發(fā)育調控,在細胞及組織內的表達,在具有局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)內受到的調控,在前體mRNA選擇性剪接中的功能及作用的下游基因進行了研究。研究結果提示,作為一個有多個功能域的鋅指蛋白,ZNF265對于基因的選擇性剪接、細胞的分化及
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