熒光定量PCR分型法檢測(cè)乙肝病毒B、C基因型的方法學(xué)評(píng)價(jià)及應(yīng)用研究.pdf

1、目的：對(duì)本實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量分型PCR法的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),檢驗(yàn)初步臨床應(yīng)用效果,明確重慶地區(qū)HBV基因型分布情況。
　　 方法：從退火溫度、探針引物濃度比方面對(duì)熒光定量分型PCR反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化,建立熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并對(duì)該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性指標(biāo)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。通過將熒光定量分型PCR法與直接測(cè)序法和多重PCR分型法比較,并用TA克隆測(cè)序法對(duì)檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)熒光定量

2、分型PCR法進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。最后將熒光定量分型PCR法用于檢測(cè)207份重慶地區(qū)HBV感染者的基因型,觀察其臨床初步應(yīng)用效果。
　　 結(jié)果：經(jīng)過優(yōu)化后將熒光定量分型PCR法的退火溫度定為62℃,探針濃度定為0.3μM,引物濃度定為0.5μM。該分型法的線性范圍為102-109copies/ml,靈敏度高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好,具有操作簡(jiǎn)便、檢出快速的優(yōu)點(diǎn)。在對(duì)113份樣本進(jìn)行分型檢測(cè)中,熒光定量分型PCR和直接測(cè)序法檢出率100％,

3、多重PCR法檢出率94.69%,6份樣本未能分型。熒光定量分型PCR和多重PCR的Kappa系數(shù)0.915,熒光定量分型PCR和直接測(cè)序法的Kappa系數(shù)0.742,一致性均較好。對(duì)B、C基因型混合感染樣本,熒光定量分型PCR法檢出28例(24.78%),多重PCR法檢出19例(16.81%),直接測(cè)序法檢出13例(16.81%)。熒光定量分型對(duì)基因型混合感染樣本的檢測(cè)靈敏度明顯高于直接測(cè)序和多重PCR分型法。在對(duì)重慶地區(qū)HBV基因型分

4、布特征的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn),B型127例(61.35%),C型29例(14.01%),BC混合型48例(23.19%),B型為主要基因型,B/C混合型感染率高。C基因型的病毒載量高于B型及BC混合型(P＜0.05),B基因型與BC混合型的病毒載量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室建立的熒光定量分型PCR法是一種可靠、高效、快速、簡(jiǎn)便的HBV基因分型法,尤其對(duì)混合基因型感染的檢測(cè)靈敏度高。此分型方法針對(duì)我國(guó)主要分布的