脂肪酸體外通過誘導肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制HBV復制及HBsAg分泌.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus, HBV）感染合并非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease, NAFLD）越來越多見，然而脂肪性肝病對HBV復制和相關抗原分泌的影響及其機制目前不清楚。肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ endoplasmic reticulum stress, ER stress）是參與多種肝臟疾病中常見的病理生理過程。為了解脂肪性肝病對HBV DNA復制及HBsA

2、g分泌的影響，本研究通過建立慢性HBV感染合并脂肪性肝病細胞模型，初步探討脂肪酸對HBV復制的影響及其機制。
　　方法：以HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2.2.15細胞為研究對象，用硬脂酸（stearic acid, SA）、油酸（oleic acid, OA）誘導細胞發(fā)生脂肪變性，應用MTS法檢測SA、OA對細胞增殖活力的影響，應用油紅O-蘇木精染色觀察細胞內(nèi)脂滴形成情況，GPO-PAP法檢測細胞內(nèi)甘油三酯（triglyce

3、ride, TG）含量，確定慢性HBV感染合并脂肪性肝病細胞模型的建立。應用Western Blotting（WB）技術檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78, GRP78）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor2α, eIF2α）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶（PKR-like ER kinase, PERK）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol

4、 regulatory element binding protein1c, SREBP1c）的表達及磷酸化水平來判斷細胞ER stress；應用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測培養(yǎng)上清 HBV DNA載量、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）檢測細胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBeAg水平來判斷HBV復制水平。進一步分別用4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, PBA）及GRP78小干擾RNA(small in

5、terfering RNA, GRP78 siRNA)減輕ER stress及阻斷GRP78表達，觀察脂肪酸對HepG2.2.15細胞HBV復制的影響。
　　結(jié)果：
　　1、SA和OA誘導HepG2.2.15細胞發(fā)生脂肪變性。100μM SA及0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞后，隨著時間的延長，細胞內(nèi)脂滴增多增大，并出現(xiàn)融合現(xiàn)象；細胞內(nèi)TG的合成也顯著增加。成功構(gòu)建了慢性HBV感染合并脂肪性肝病細胞模型。<

6、br>　　2、SA和OA誘導HepG2.2.15細胞ER stress。用50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞48h后，GRP78表達均顯著增加；100μM SA及0.2mM OA作用于HepG2.2.15細胞后，GRP78表達水平、PERK及eIF2α磷酸化水平、SREBP1c表達水平從24h至72h時間依賴性增加。以上結(jié)果證實SA及OA時間及濃度依賴性誘導

7、HepG2.2.15細胞ER stress。
　　3、SA和OA抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA在48h濃度依賴性抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌；200μM SA時顯著抑制HBeAg分泌；100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞24h至72h后，細胞外HBsAg分泌顯著降低，HBeAg分泌也有下降但無

8、統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果證實SA及OA時間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌。
　　4、SA和OA抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA復制。50μM、100μM、200μM SA及0.1mM、0.2mM、0.4mM OA作用于HepG2.2.15細胞48h，細胞外HBV DNA水平濃度依賴性降低；100μM SA和0.2mM OA分別作用于HepG2.2.15細胞后，從24h至72h細胞外HBV DNA水平顯

9、著降低。以上結(jié)果證實SA及OA時間及濃度依賴性抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA復制。
　　5、脂肪酸體外通過誘導ER stress抑制HepG2.2.15細胞HBsAg分泌和HBV DNA復制。用PBA減輕SA和OA誘導的HepG2.2.15細胞ER stress后，HBsAg分泌及HBV DNA復制水平顯著增加。以上結(jié)果說明脂肪酸通過誘導 HepG2.2.15細胞 ER stress抑制HBV復制及HBsAg分泌。

10、r>　　6、GRP78 siRNA對HepG2.2.15細胞HBV復制的影響。首先發(fā)現(xiàn)GRP78 siRNA顯著抑制SA誘導的GRP78表達，但我們觀察到用GRP78 siRNA抑制GRP78表達后，SA對HBsAg分泌及HBV DNA的抑制作用并未減輕，說明脂肪酸可能并不通過誘導GRP78表達抑制HBsAg的分泌和HBV DNA復制。
　　結(jié)論：脂肪酸體外通過誘導肝細胞ER stress抑制HBsAg分泌和HBV DNA復制，初