新疾病——外傷后細菌性致死性肉芽腫病原菌分子生物學鑒定及發(fā)病機制初步探索.pdf

1、引言：外傷后細菌性致死性肉芽腫(Fatalbacteriagranulomaaftertrauma，FBGT)是由高天文教授發(fā)現并命名的一種新疾病，該病在面部外傷愈合后發(fā)生，預后極差，患者死亡時均有腦部受累癥狀。以往國內多位專家曾先后診治過近20例，進行了認真的普通細菌分離、厭氧菌分離、真菌培養(yǎng)等研究，均未獲陽性結果；曾診為“結節(jié)病、真菌感染”，給予糖皮質激素、抗生素、抗結核、抗真菌等治療，效果不佳，患者全部在發(fā)病后的1到4年內死亡。在

2、總結、分析前人分離、培養(yǎng)該病病原失敗的基礎上，采取嚴格厭氧、運送培養(yǎng)基及增菌肉湯等改進措施后，本課題組其他成員終于成功地從4例FBGT患者的皮損組織中分離培養(yǎng)出病原菌，初步研究表明該菌為革蘭陽性桿菌，但具體種屬不明。由于病原菌種屬、患者的致死機理等不明，盡管采取各種積極的治療措施，除我們所救治的6例患者中有1例獲救外，至今尚無救治成功的病例。FBGT的發(fā)病機制、致死機理的闡明已成為救治患者的關鍵。 目的： 1.分別采取P

3、CR擴增FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA、測序結果BLAST比對及患者分離菌與P.acnes標準株DNA雜交方法明確病原菌的種屬；采用細菌16SrRNAPCR的方法，檢測2例行尸檢患者(病例2和3)的病變腦組織是否存在細菌，闡明患者死亡原因，測序結果與皮損分離菌序列比對，明確腦內細菌是否與各自患者皮損分離菌為同一細菌，進一步證實從患者皮損分離的細菌就是FBGT的病原菌。 2.通過PCR擴增病例2的IFN-γ相關分子(IA

4、M，包括IFN-γR1、R2、STAT1、IL-12β、IL-12Rβ1、β2和STAT4)的所有外顯子，測序結果與多個數據庫的野生型序列比較，尋找可能引起相應的IAM分子功能缺陷的多態(tài)性位點，初步明確FBGT的發(fā)病機制。 方法： 1.FBGT患者皮損分離病原菌分子生物學鑒定及死亡原因分析 1)4例FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA鑒定 (1)提取皮損分離菌的基因組DNA； (2)利用細菌通

5、用引物擴增皮損分離菌的16SrRNA； (3)測序結果通過BLAST與已知細菌的16SrRNA序列進行同源 性比對，明確FBGT患者皮損分離菌的具體種屬。 2)皮損分離病原菌與P.acnes標準株DNA雜交 (1)DNA結合：采用共價法結合DNA到微孔板法進行DNA-DNA雜交，每個樣品4個平行重復； (2)標記DNA：photo-activatablebiotin(PAB)標記探針DNA；

6、 (3)雜交 (4)測定雜交率：50℃雜交12小時，分別用2×SSC-0.1％Tween2050℃和室溫洗3次(15分鐘)，堿性磷酸酶法FLUOstarOPTIMA(BMD)測定雜交率(360nm激發(fā)和460nm輻射)。 3)2例死亡患者病變腦組織細菌16SrRNA檢測、死亡原因分析(1)提取2例行尸檢患者(病例2和3)的病變腦組織基因組DNA； (2)病變腦組織細菌16SrRNAPCR檢測，明確患者死亡原因；

7、 (3)測序結果分別進行BLAST比對，初步明確病變腦組織內細菌的種屬，并與各自患者皮損分離菌的16SrRNA序列進行比較，明確病變腦組織內的細菌與皮損分離菌是否為同一細菌，進一步證實皮損分離菌就是FBGT的病原菌。 2.IAM基因外顯子擴增、功能缺陷多態(tài)性位點確定在本課題第一部分已明確P.acnes就是FBGT的致病菌的基礎上，通過綜合分析FBGT患者的表型，結合P.acnes毒力低，為胞內寄生菌等特點，充分借鑒他人研

8、究成果，提出了IAM基因多態(tài)性是FBGT發(fā)病的重要機制的假說。進行了以下工作： 1)設計IAM相關分子基因所有外顯子(包含5'和3端的片區(qū))的引物，并對引物進行BLAST比對，確保特異擴增； 2)PCR擴增，直接測序，測序結果與多個基因多態(tài)性數據庫(http：//egp.gs.washington.edu/、Genecard等)的野生型序列比較，找出多態(tài)性位點； 3)針對此多態(tài)性位點重新設計引物，無關正常對照(1

9、0人)的相應外顯子PCR擴增，直接測序，證實正常人不存在此多態(tài)性位點； 4)通過PCR—單酶切分析進一步證實病例2的多態(tài)性位點，并明確等位基因型； 5)綜合分析所發(fā)現多態(tài)性位點對相應基因的結構(三維構像等)、表達和功能可能的影響，進而確認能引起相應分子功能缺陷的多態(tài)性位點，初步明確FBGT的發(fā)病機制。 結果： 1.FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA鑒定、病變腦組織細菌16SrRNA檢測和死亡原因分析

10、 1)4例FBGT患者皮損分離病原菌16SrRNA基因序列經BLAST比對后與已知P.acnes(AB097215.1GI：26006299)的同源性達99％，皮損分離病原菌為P.acnes; 2)2例尸檢患者病變腦組織內均可檢測到細菌16SrRNA片段，患者死于細菌引起的腦感染；PCR測序結果與相應患者皮損分離菌的16SrRNA序列完全一致，腦內細菌與皮損分離菌為同一細菌。 2.IAM基因外顯子擴增、功能缺陷多

11、態(tài)性位點確定 1)通過PCR測序與數據庫比對，發(fā)現IAM重要成員-IL-12Rβ1基因第五外顯子存在一個錯義突變(271G→A)，可引起所編碼氨基酸的改變(91T→A)，未發(fā)現其他IAM分子基因外顯子存在無義或錯義突變； 2)檢索多個多態(tài)性數據庫(http：//egp.gs.washington.edu/、Genecard等)，未發(fā)現與IL-12Rβ1基因第五外顯子錯義突變(271G→A)一致的多態(tài)性位點； 3)

12、10名正常對照IL-12Rβ1基因第五外顯子在相應多態(tài)性位點均為野生型(271G/G)； 4)PCR-NaeI單酶切分析進一步證實病例2的IL-12Rβ1基因第五外顯子突變?yōu)闉榧兒闲湾e義突變(271A/A)： 5)IL-12Rβ1的錯義突變(271G→A)位于配體識別的關鍵區(qū)域，該突變可引起所編碼氨基酸的理化性質改變(疏/親水性)，進而引起IL-12Rβ1三維構像改變，綜合分析證實此錯義突變(271G→A)可引起IL-1

13、2Rβ1與配體結合能力下降，導致IL-12Rβ1功能缺陷。 結論： 1.本研究在以往研究的基礎上，通過分子生物學方法明確了P.acnes為新疾病FBGT的病原，患者的死亡原因為P.acnes所致的腦感染。 2.依據FBGT的臨床特點，通過廣泛查閱相關文獻，提出IAM基因多態(tài)性引起相應分子功能的缺陷是FBGT發(fā)病機制的假說；以此為基礎，檢測了病例2的IAM基因的所有外顯子，發(fā)現IAM的重要成員-IL-12Rβ1第5