口服沙門菌遞送治療性HBV-HSP70融合NDA疫苗的實驗研究.pdf

1、慢性乙型肝炎(CHB)嚴重危害人類健康,臨床上尚無理想治療手段,目前主要用核苷類藥物和干擾素進行治療,但是并不能完全治愈乙型肝炎,且長期使用會使HBV產生耐藥突變并具有較大的副作用。乙型肝炎病毒感染人體后發(fā)生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特異性細胞免疫,無法清除體內的病毒。DNA疫苗由于在誘導機體特異性細胞免疫應答方面的優(yōu)勢,被廣泛關注.但是經過多年來的研究,DNA疫苗仍未走進臨床,重要原因之一就是隨著受試動物體形的增大,DNA疫

2、苗誘導免疫應答的能力迅速下降；此外缺乏滿意的遞送方式也是DNA疫苗發(fā)展的主要阻礙。因此,如何在安全的前提下,采取有效的遞送方式和加強誘導的免疫應答,特別是加強細胞免疫應答水平,是目前研制有效DNA疫苗的關鍵問題。使用分枝桿菌熱休克蛋白70羧基端(HSP70c)或T細胞刺激表位(HSP70t)基因構建融合基因疫苗可以起到佐劑的作用,同時減少機體針對HSP70的免疫應答.利用攜帶DNA質粒的減毒傷寒沙門菌口服,可直接將DNA質粒遞送至抗原呈

3、提細胞,極大提高DNA疫苗的利用率,同時口服的免疫方式安全方便,易于為患者接受.使用DNA疫苗初次免疫-痘苗病毒Ankara株(MVA)載體疫苗加強免疫的策略也可以有效增強機體的免疫應答。采取多種免疫增強策略綜合應用,可以更好的優(yōu)化DNA疫苗的免疫效果。
　　 本研究通過HBV基因與HSP70c或HSP70t基因構建融合基因疫苗、使用口服減毒傷寒沙門菌遞送DNA疫苗和利用MVA載體疫苗強化免疫等多種手段,探索提高HBV DNA疫

4、苗誘導特異性免疫應答的更佳優(yōu)化條件。首先,將乙肝病毒preC/C基因或preS2/S基因、HSP70c基因或HSP70t基因分別先后插入VR1012載體,獲得含HBV preC/C-HSP70c、HBV preC/C-HSP70t、HBVpreS2/S-HSP70c和HBV preS2/S-HSP70t融合基因的DNA疫苗。再將構建好的重組DNA疫苗轉染HepG2細胞,ELISA法和化學發(fā)光法檢測目的抗原,證實重組DNA疫苗可以正確表達

5、目的蛋白并具有抗原性.然后,將重組DNA疫苗電轉化減毒傷寒沙門菌SL7207,獲得穩(wěn)定的攜帶重組DNA疫苗的重組減毒沙門菌。最后,分別采用HBV DNA疫苗肌肉注射初次免疫+MVA載體疫苗腹腔注射加強免疫、HBV-HSP70融合DNA疫苗肌肉注射初次免疫+MVA載體疫苗腹腔注射加強免疫、攜帶HBV DNA疫苗的重組減毒沙門菌口服初次免疫+MVA載體疫苗腹腔注射加強免疫和攜帶HBV-HSP70融合DNA疫苗的重組減毒沙門菌口服初次免疫+M

6、VA載體疫苗腹腔注射加強免疫的方案,免疫Balb/c小鼠,收集血清和脾淋巴細胞檢測特異性免疫應答。體液免疫方面,采用ELISA檢測血清特異性抗體,結果顯示各實驗組均可誘導小鼠產生特異性抗體,抗體產生的時間和水平的差異無統計學意義。細胞免疫方面通過流式細胞術檢測CD3+CD4+/CD3+CD8+T細胞比值評估非特異性細胞免疫水平,ELISpot檢測肽刺激脾淋巴細胞分泌IFN-γ評估特異性細胞免疫效果,結果顯示無論是特異性還是非特異性細胞免