NDM-1泛耐藥菌流行病學(xué)及分子特征研究.pdf

1、人類(lèi)與各種感染性疾病的斗爭(zhēng)中，抗生素起到關(guān)鍵作用，但由抗菌素應(yīng)用產(chǎn)生的抗生素耐藥問(wèn)題逐漸顯現(xiàn)，尤其是近幾十年來(lái)，由于抗生素使用不當(dāng)?shù)葐?wèn)題加速了細(xì)菌耐藥問(wèn)題的惡化，給臨床治療帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。尤其2009年新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1）的出現(xiàn)和流行更新了人們對(duì)“超級(jí)細(xì)菌”的認(rèn)識(shí)，引起了世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注和恐慌，最初報(bào)道的產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌對(duì)除了多粘菌素和替

2、加環(huán)素以外的所有抗生素耐藥，截止2016年，NDM-1耐藥菌已經(jīng)在全球范圍內(nèi)形成總體散發(fā)，局部地區(qū)高流行的流行趨勢(shì)，越來(lái)越多的研究表明以NDM-1耐藥基因?yàn)榇淼募?xì)菌耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為健康和食品安全領(lǐng)域的最大威脅之一，能對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生巨大隱患。
　　目前，我國(guó)大量報(bào)道了關(guān)于產(chǎn)NDM-1陽(yáng)性菌的流行、blaNDM-1耐藥譜及傳播機(jī)制和遺傳學(xué)特征等研究。報(bào)道的NDM-1陽(yáng)性菌大部分為臨床個(gè)案報(bào)道，病例之間無(wú)流行病學(xué)研究和聯(lián)系，對(duì)于NDM

3、-1陽(yáng)性菌在全國(guó)的流行病學(xué)特征尚不明確，攜帶NDM-1菌株的特性及其播散的機(jī)制仍不清楚，給NDM-1的整體治療、防控帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。因此，需系統(tǒng)研究NDM-1陽(yáng)性菌株在各地的分布情況、病人類(lèi)型、醫(yī)療環(huán)境、危險(xiǎn)因素以及流行病學(xué)溯源和NDM-1分子特征和變異情況。
　　基于以上現(xiàn)況，本研究在CNKI和PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了從2007年1月至2015年12月所有報(bào)道中國(guó)產(chǎn)NDM-1細(xì)菌研究的中英文文獻(xiàn)，共檢索中英文文獻(xiàn)767篇，排除

4、陰性結(jié)果文獻(xiàn)、綜述、NDM-1分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究、非人感染、中英文重復(fù)文獻(xiàn)，共納入研究文獻(xiàn)50篇。對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的NDM-1陽(yáng)性菌株的流行病學(xué)特征，菌株來(lái)源、耐藥譜及傳播機(jī)制等方面信息進(jìn)行匯總和分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：截至2015年12月，我國(guó)共有25個(gè)省市、地區(qū)報(bào)道blaNDM-1陽(yáng)性菌株，其中東南部沿海地區(qū)分布較多，廣東地區(qū)報(bào)道的陽(yáng)性病例為109例，占39.49％，明顯多于其他地區(qū)(P<0.05)，NDM-1陽(yáng)性菌主要分布在肺炎克雷伯菌和陰溝腸

5、桿菌(P<0.05)；感染NDM-1陽(yáng)性菌的男性患者明顯多于女性患者(P<0.01)，主要集中在2個(gè)年齡段：10歲以下和60~80歲之間(P<0.05)；NDM-1陽(yáng)性菌主要分離于痰液標(biāo)本，為40株，占41.24%(P<0.05)，NDM-1陽(yáng)性菌感染的病例主要分布在ICU、兒科和呼吸科(P<0.05)，肺部疾病患者更容易分離出陽(yáng)性菌(P<0.05)，blaNDM-1陽(yáng)性菌對(duì)阿米卡星、替加環(huán)素的總體耐藥率最低，分別為7.69%和2.33

6、%。
　　文獻(xiàn)分析顯示我國(guó)共有13個(gè)菌屬276株細(xì)菌攜帶NDM-1基因，blaNDM-1編碼在大小為55kb～360kb范圍的質(zhì)粒上，表明編碼blaNDM-1的質(zhì)粒不僅可以實(shí)現(xiàn)高效水平傳播，還具有較強(qiáng)的跨種傳播能力；結(jié)果分析顯示NDM-1陽(yáng)性菌對(duì)34種抗生素的耐藥性，只有對(duì)阿米卡星和多粘菌素E的耐藥率低于10%，甚至還對(duì)9種抗生素出現(xiàn)100%耐藥情況，證實(shí)了NDM-1陽(yáng)性菌具有強(qiáng)耐藥性。說(shuō)明產(chǎn)NDM-1陽(yáng)性菌感染已經(jīng)在全國(guó)范圍流行

7、和傳播，需要進(jìn)一步開(kāi)展主動(dòng)監(jiān)測(cè)，深入研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律。
　　為進(jìn)一步系統(tǒng)比較產(chǎn)NDM-1陽(yáng)性菌的流行病學(xué)及生物學(xué)特性，本次研究選取全國(guó)5個(gè)地區(qū)8個(gè)臨床哨點(diǎn)醫(yī)院收集多重耐藥菌株樣本，使用梅里埃VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定和藥敏測(cè)定，對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的細(xì)菌標(biāo)本使用普通PCR和實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行NDM-1陽(yáng)性菌篩查，對(duì)篩選出的陽(yáng)性菌株使用E-test法進(jìn)行金屬酶表型鑒定。
　　在

8、篩查的2367份樣本中，一共鑒定出5份NDM-1陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為0.21%，通過(guò)菌種鑒定顯示1株為肺炎克雷伯菌，其他4株均為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌，藥敏結(jié)果顯示：肺炎克雷伯菌只對(duì)多粘菌素和替加環(huán)素敏感，4株不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌對(duì)慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、多粘菌素和替加環(huán)素呈現(xiàn)敏感或中度耐藥。E-test法檢測(cè)5株NDM-1陽(yáng)性菌金屬酶表型驗(yàn)證試驗(yàn)均為陽(yáng)性。
　　通過(guò)上以上研究發(fā)現(xiàn)，雖然NDM-1耐藥菌已經(jīng)在我國(guó)部分醫(yī)院中傳播，

9、但本次監(jiān)測(cè)的哨點(diǎn)醫(yī)院患者NDM-1耐藥基因陽(yáng)性率比文獻(xiàn)報(bào)道的檢出率較低。篩選的5株NDM-1陽(yáng)性菌株有4株（80%）為不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌和1株肺炎克雷伯菌與國(guó)內(nèi)NDM-1陽(yáng)性菌流行現(xiàn)況分析結(jié)果一致，顯示我國(guó)NDM-1耐藥基因主要在腸桿菌科細(xì)菌中不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中流行和傳播。攜帶blaNDM-1不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌不僅僅對(duì)多粘菌素和替加環(huán)素敏感。
　　為了進(jìn)一步研究NDM-1耐藥基因所在質(zhì)粒位置及周?chē)蛄薪Y(jié)構(gòu)特征，以期揭示耐藥基因的分子特征。首

10、先應(yīng)用Southern blot法對(duì)blaNDM-1進(jìn)行基因定位；通過(guò)PCR mapping進(jìn)一步鑒定 NDM-1所在質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)；使用試劑盒提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行高通量測(cè)序。
　　通過(guò)Southern blot法對(duì)5株NDM-1陽(yáng)性菌進(jìn)行基因定位發(fā)現(xiàn)：4株NDM-1陽(yáng)性菌blaNDM-1均編碼于質(zhì)粒上，1株NDM-1陽(yáng)性菌blaNDM-1丟失。其中3株NDM-1陽(yáng)性菌blaNDM-1分別編碼在大小約30-6kb的質(zhì)粒，分別為Pm13

11、1-NDM-1、PNDM-BJ02、PAbNDM-1，1株NDM-1陽(yáng)性菌blaNDM-1編碼在大小約240-280kb質(zhì)粒上。按照4個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)增19對(duì)引物鑒定質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，通過(guò)PCR mapping鑒定2個(gè)NDM-1陽(yáng)性菌攜帶NDM-1耐藥基因的質(zhì)粒為pNDM-BJ01。
　　4株細(xì)菌編碼NDM的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示：所有NDM-1陽(yáng)性菌質(zhì)粒均含有經(jīng)典的Tn125轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，但Tn125下游結(jié)構(gòu)均發(fā)生丟失，NJ-18號(hào)和305-118號(hào)細(xì)

12、菌質(zhì)粒在Tn125上游有插入序列IS26和IS5，該插入序列可能介導(dǎo)NDM-1耐藥基因進(jìn)行跨種傳播，而305-118號(hào)細(xì)菌NDM耐藥基因亞型為NDM-5。
　　綜上所述，本研究結(jié)果顯示：
　　（1）我國(guó)blaNDM-1呈現(xiàn)整體散發(fā)局部流行的流行現(xiàn)狀，具備獨(dú)特流行病學(xué)特點(diǎn)，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌是blaNDM-1的主要優(yōu)勢(shì)菌，需要進(jìn)一步開(kāi)展主動(dòng)監(jiān)測(cè)，深入研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律；
　?。?）產(chǎn)NDM-1陽(yáng)性菌株在我國(guó)部分醫(yī)院呈散發(fā)狀態(tài)

13、，病例之間無(wú)流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，陽(yáng)性檢出率低于文獻(xiàn)報(bào)道平均水平；
　　（3）blaNDM-1基因可能會(huì)在基礎(chǔ)體質(zhì)和免疫力較差人群或人群所在地點(diǎn)暴發(fā)流行，菌株主要集中在不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌，還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注肺炎克雷伯菌。
　?。?）blaNDM-1位于質(zhì)粒上，其全長(zhǎng)30kb左右，1株NDM-1耐藥菌質(zhì)粒全長(zhǎng)約240-280kb，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)顯示均含有Tn125轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，且其下游結(jié)構(gòu)部分缺失，部分Tn125結(jié)構(gòu)上游含有插入序列IS26和IS5，T