鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究——以及蛋白質(zhì)分泌組新毒力因子的鑒定.pdf

1、本論文涉及兩個部分，即《鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究》和《鼠疫耶爾森氏菌蛋白質(zhì)組學分析及新毒力因子的鑒定。摘要及正文將分為兩個部分撰寫。
　　摘要一鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究
　　III型分泌系統(tǒng)（Type III Secretion System,T3SS）是一種高度保守的毒力機制，廣泛分布于革蘭氏陰性菌中，能夠?qū)⑿鞍字苯臃置诘剿拗骷毎募毎?/p>

2、質(zhì)中。該系統(tǒng)的結(jié)構類似于一支注射器，由兩部分組成，分別是橫跨于細菌內(nèi)膜、周質(zhì)及外膜的多環(huán)基座以及將毒力蛋白輸送到宿主細胞內(nèi)的中空針頭。鼠疫菌的T3SS由pCD1質(zhì)粒編碼而成，是由20余種蛋白質(zhì)構成的一種超分子復合物，含有許多高度保守結(jié)構，通過耗能將分泌性V抗原(LcrV)和耶爾森氏菌外膜蛋白(Yersinia outerproteins,Yops)由宿主細胞表面形成的小孔結(jié)構注入到宿主細胞內(nèi)，從而達到干擾細胞發(fā)揮其正常生理功能的目的。<

3、br>　　鼠疫菌的pCD1質(zhì)粒共編碼90多個基因，除去部分假基因和轉(zhuǎn)座酶相關基因后，共57個基因編碼T3SS相關蛋白。在本實驗室的前期工作中，已通過酵母雙雜交陣列篩選技術篩選到57個蛋白之間的21個相互作用對，其中新發(fā)現(xiàn)12對，包括YscF-YscI。YscF的多聚體在細菌表面形成注射小體的針狀結(jié)構，YscI是連接T3SS裝置分泌通道內(nèi)外環(huán)的蛋白。前期實驗中已采用GST-pull down驗證了YscI-YscF體外存在相互作用，并通過

4、構建YscI截短突變體的方法確定介導二者體外相互作用的結(jié)構域位于 YscI的第83-92位氨基酸。本研究中，將通過免疫共沉淀等方法繼續(xù)驗證YscF-YscI的體內(nèi)相互作用關系，并探討其相互作用的生理功能。
　　首先，本研究利用λ-Red重組系統(tǒng)構建鼠疫菌yscI基因突變株。再以阿拉伯糖誘導的pBAD24質(zhì)粒為載體構建帶FLAG標簽的yscI互補株及yscI截短突變體，并將成功構建的新載體導入yscI突變株，分別為△yscI-FLA

5、G-YscI、△yscI-C△73-85、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102和△yscI-C△93-102。接下來，運用免疫共沉淀（Co-IP）的方法在FLAG樹脂結(jié)合下來的樣品中檢測到了YscF蛋白，驗證了YscI-YscF在體內(nèi)存在相互作用；并使用同樣的實驗方法對不同突變菌株進行檢測，結(jié)果，對△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102菌株的Co-IP實驗中，F(xiàn)LAG樹脂結(jié)合下來的樣品中未檢測到Y(jié)s

6、cF蛋白。以上結(jié)果說明，影響YscI-YscF體內(nèi)相互作用的關鍵結(jié)構域位于YscI蛋白C末端的第83-102位氨基酸。
　　本研究分別運用YscF聚合體交聯(lián)的方法檢測上述構建的yscI互補株以及yscI截短突變株在細菌表面組裝YscF針狀結(jié)構的能力；運用WB免疫印跡的方法檢測其表達及分泌YscI、YscF以及效應蛋白YopN、YopM、YopE、YopK和LcrV的能力。結(jié)果表明：鼠疫菌yscI互補株和yscI截短突變株均可以在菌

7、體內(nèi)表達YscI和YscF，但不能分泌到上清中；在△yscI、△yscF和△yscI-C△83-92的菌體表面未檢測到 YscF多聚體，在其分泌上清中也未檢測到效應蛋白；在△yscI-C△93-102細菌表面能檢測到Y(jié)scF多聚體，但該菌株不能夠正常分泌效應蛋白。以上結(jié)果闡明，當YscI的第83-92位氨基酸缺失時，該突變株不能形成針狀結(jié)構且無法分泌效應蛋白；當?shù)?3-102位氨基酸缺失時，該菌株組裝YscF針狀結(jié)構的能力受到一定影響，

8、但其分泌效應蛋白的功能并未完全喪失。
　　針對YscI的83-92位氨基酸區(qū)域進行序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)YscI的第85、86、88和92位氨基酸與YscF同源性高。因此，本研究構建了C末端帶有FLAG標簽的yscI點突變體，并導入yscI突變株，分別為△yscI-CW85A、△yscI-CS86A、△yscI-CI88A以及△yscI-CI92A。利用免疫共沉淀方法檢測與YscF體內(nèi)相互作用，結(jié)果在對△yscI-CW85A、△yscI

9、-CS86A菌株的Co-IP實驗中，F(xiàn)LAG樹脂結(jié)合下來的樣品中未檢測到Y(jié)scF蛋白。利用GST-pull down方法檢測與YscF體外相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YscI-W85A或YscI-S86A與YscF未發(fā)生結(jié)合。以上結(jié)果表明，YscI第85或86位氨基酸的缺失，同時影響了YscI與YscF之間體內(nèi)外的相互作用。
　　本研究進一步發(fā)現(xiàn)無法在△yscI-CW85A和△yscI-CS86A的細菌表面檢測到Y(jié)scF多聚體，也無法在其上

10、清中檢測到效應蛋白。這一結(jié)果闡明，YscI的第85或86位氨基酸缺失導致YscI-YscF失去相互作用，并且該突變株也不能形成針狀結(jié)構和分泌效應蛋白。
　　本研究還通過觀察細菌感染Hela細胞后形態(tài)的變化，以及用無標記細胞實時定量分析法研究鼠疫菌yscI截短及點突變株的細胞毒性。在顯微鏡下，我們看到野生株鼠疫菌感染3h后的Hela細胞明顯變圓，表明效應蛋白破壞細胞骨架；而△yscI、△yscF、△yscI-C△83-92、△ysc

11、I-C△93-102、△yscI-CW85A以及△yscI-CS86A感染的Hela細胞形態(tài)更接近于正常細胞，這說明以上菌株對Hela細胞的毒力作用已大幅度減弱。本研究還利用免疫印跡的方法檢測了yscI截短及點突變株感染 Hela細胞后向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運效應蛋白的能力，結(jié)果表明對HeLa細胞毒力明顯減弱的幾株突變株同樣不能將效應蛋白LcrV、YopM和YopE轉(zhuǎn)運到細胞胞漿中。
　　摘要二鼠疫耶爾森氏菌蛋白質(zhì)組學分析及新毒力因子的鑒定

12、r>　　鼠疫（plague）是由鼠疫耶爾森氏菌引起的烈性傳染病，主要由節(jié)肢動物跳蚤通過叮咬傳染給宿主嚙齒類動物，并有可能傳播給人導致腺鼠疫、肺炎鼠疫和敗血癥等的發(fā)生，給人們造成了巨大的生命和財產(chǎn)損失。本研究利用蛋白質(zhì)組技術，在鼠疫菌全基因組測序已完成的基礎上，對鼠疫菌201株在兩種不同的生理條件下，即26℃含鈣（模擬跳蚤體內(nèi)環(huán)境）和37℃低鈣（模擬哺乳動物體內(nèi)環(huán)境）的蛋白質(zhì)組展開研究，并進一步發(fā)現(xiàn)鼠疫菌致病的新的關鍵毒力因子，為防治鼠疫

13、菌和新疫苗研究提供更多方法和靶標。
　　首先，本研究制備出鼠疫菌在26℃含鈣和37℃低鈣培養(yǎng)條件下的分泌蛋白質(zhì)組和菌體蛋白質(zhì)組。該過程主要使用 TMH人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠疫菌，在兩種條件下培養(yǎng)8h，然后使用超濾法進行上清蛋白的濃縮，菌體用含尿素裂解液裂解，并用BCA試劑盒測量菌體蛋白和上清蛋白的濃度。此外，為了實現(xiàn)對鼠疫菌T3SS不同蛋白質(zhì)組分的動態(tài)監(jiān)控，在8h分泌時間內(nèi)選擇了一系列時間點作為分泌時間，分別為，80min、160m

14、in、240min、320min、400min和480min，制備出不同時間序列的分泌蛋白質(zhì)組及菌體蛋白質(zhì)組樣品。
　　在本研究中，我們通過同量異序化學標簽（Tandem Mass Tags，TMT）法對樣品進行定量分析。TMT是通過串聯(lián)質(zhì)譜同時定量鑒定不同樣品中蛋白質(zhì)的有效工具。這些小化學分子標簽的結(jié)構類似，以共價結(jié)合賴氨酸的氨基末端的方式標記蛋白樣品中的多肽。在質(zhì)譜分析中，每種分子量的TMT標簽都能生成一個特殊的離子圖譜，通過

15、比較不同標簽標記的離子的相對豐度實現(xiàn)了對蛋白的相對定量。我們共檢測到2141個鼠疫菌蛋白質(zhì)，占基因組預測CDS的52.2％。其中1081個蛋白質(zhì)同時出現(xiàn)在分泌和菌體蛋白質(zhì)組中。將Score≥5和Unique Peptide≥2作為定義潛在分泌蛋白的標準，共在培養(yǎng)上清中檢測到767個分泌蛋白，其中Yp-2058、Yp-3657和Yp_3415-Yp_3418幾種未知功能的蛋白在37℃表達上調(diào)，可能與鼠疫菌在宿主動物中的毒力密切相關。

16、>　　在研究T3SS的分泌蛋白動態(tài)變化實驗中，根據(jù)不同時間序列的蛋白質(zhì)組樣品的質(zhì)譜結(jié)果分析，未觀察到鼠疫菌T3SS蛋白組分隨時間的蛋白特異性變化規(guī)律，推測可能是由于最短分泌時間80min時，分泌蛋白質(zhì)種類已基本趨于穩(wěn)定。本研究建立了一種新方法分辨哪些蛋白是T3SS的分泌蛋白，即將上清/菌體的PSM值大于1作為分泌蛋白的評判標準。發(fā)現(xiàn)根據(jù)上清/菌體的 PSM值大于1為標準判斷鑒定出的 T3SS分泌底物的蛋白，均是文獻中已經(jīng)報道的分泌蛋白；

17、而那些比值小于1的蛋白為T3SS結(jié)構蛋白、ATP酶以及轉(zhuǎn)運蛋白等。
　　在分子實驗部分中，針對篩選出的高表達分泌蛋白質(zhì)Yp_3416、Yp_3417、Yp_3418、Yp_2058和Yp_3657進行毒力及功能的驗證。本研究采用基于pDS132自殺載體的方法構建yp_3416、yp_3418和yp_3416-3418的無痕突變株。分別以尾靜脈感染途徑和滴鼻感染途徑對小鼠進行攻毒實驗，繪制出生存曲線。結(jié)果表明，經(jīng)尾靜脈感染后，鼠疫菌

18、野生株與yp_3416突變株，yp_3416-3418突變株的生存曲線差異有統(tǒng)計學意義，與yp_3418突變株無差異；滴鼻感染結(jié)果中，野生株與以上3株突變株的差異均有統(tǒng)計學意義。本研究還構建出yp_3416、yp_3417、yp_3418、yp_2058和yp_3657的β-內(nèi)酰胺酶（TEM）報告質(zhì)粒，導入鼠疫菌野生株后，分別感染 Hela細胞。當靶蛋白進入宿主細胞時，與靶蛋白融合表達的β-內(nèi)酰胺酶可降解細胞內(nèi)CCF2-AM染料分子，在