尿酸酶的聚乙二醇修飾及其成藥性的初步評價.pdf

1、大腸桿菌重組表達苛求芽孢桿菌(ATCC29604)尿酸酶,為同源四聚體,序列中每條多肽鏈含有17個氨基,經兩次DEAE-cellulose柱純化后比活性達到6.0 IU/mg。在大鼠體內的代謝半衰期只有10-15min,并顯示出較強的免疫原性。聚乙二醇修飾是提高蛋白質成藥性的主要手段。本文優(yōu)化單甲氧基聚乙二醇(mPEG)修飾此重組表達尿酸酶的條件,并初步評價mPEG修飾尿酸酶的成藥性。
　　 1聚乙二醇修飾試劑的制備
　　

2、 結合尿酸酶蛋白的結構特點,用兩類方法制備了數(shù)種主要以尿酸酶蛋白表面的游離氨基作為修飾目標的修飾試劑。一類方法用單甲氧基聚乙二醇5000(mPEG5k)和350(mPEG350)先與丁二酸酐在四氫呋喃中反應,生成聚乙二醇丁二酸單酯后再與N-羥基琥珀酰亞胺經DCC脫水,制得單甲氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亞胺酯(SS-mPEG5k,SS-mPEG350),其中SS-mPEG5k收率為60-75％,SS-mPEG350收率約56%。另一類方法

3、用mPEG5k先與三氯甲基碳酸酯在二氯甲烷中反應生成單甲氧基聚乙二醇碳酰氯,再與N-羥基琥珀酰亞胺反應得琥珀酰亞胺的單甲氧基聚乙二醇碳酸酯(SC-mPEG5k),收率約87%。為比較不同體積N-羥基琥珀酰亞胺酯修飾氨基的差異,同時用乙酸與N-羥基琥珀酰亞胺在DCC作用下制得其乙酸酯(Ac-NHS),收率約90%。通過與萘替乙二胺衍生檢測活化酯同氨基的反應活性并估算其含量。
　　 2聚乙二醇修飾尿酸酶的條件優(yōu)化
　　 TN

4、BS測定氨基,考察聚乙二醇修飾劑與尿酸酶多肽鏈的數(shù)量(摩爾比)、尿酸酶氨基的修飾度等對修飾尿酸酶剩余活性的關系。
　　 摩爾比在0～100之間時,尿酸酶氨基修飾度與修飾劑用量呈良好線性關系(y=0.67·X-4.96,R2=0.99);在摩爾比接近200時,修飾度達到80%;摩爾比在200～500間修飾度平緩地接近85%。隨著修飾度增加,尿酸酶活性持續(xù)下降至原活性的17%。
　　 比較SS-mPEG5k,SS-mPEG3

5、50和乙酸琥珀酰亞胺酯衍生物對修飾產物活性的影響,發(fā)現(xiàn)SS-mPEG5k最大修飾度達到75%且對應剩余活性為60～70%,SS-mPEG350最大修飾度達到86%且對應剩余活性為23%,乙酸琥珀酰亞胺酯最大修飾度達到94%對應剩余活性為10%。
　　 兩種尿酸酶抑制劑氧嗪酸和黃嘌呤,及其底物尿酸等配體都可顯著提高SC-mPEG5k修飾后尿酸酶活性保留比例。在摩爾比為200的修飾劑用量時,無配體存在下尿酸酶修飾度達到80%但只保留

6、20-30%活性。30μM氧嗪酸可使尿酸酶修飾后保留活性達到70%、150μM黃嘌呤可使尿酸酶修飾后保留活性達到59%、(初始濃度)500μM尿酸可使尿酸酶修飾后保留活性達到53%。
　　 3 mPEG5k修飾尿酸酶成藥性的初步評價
　　 mPEG5k修飾尿酸酶的pH、Mg2+效應方面與未修飾尿酸酶相似,而其熱穩(wěn)定性以及抗蛋白酶水解能力有顯著改善。用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀(Ki≦3μM)按每天0.20mg/g的劑量對SD大

7、鼠腹腔注射持續(xù)4-6周成功建立高尿酸血癥大鼠模型,大鼠血漿尿酸水平持續(xù)保持在0.42mM以上,而體內尿酸酶抑制劑總量(氧嗪酸當量)也維持在較高的水平,對尿酸酶藥效學的評價產生顯著的干擾。因此,我們設計了體外降尿酸能力與體內代謝半衰期考察相結合的方法綜合評價mPEG5k修飾尿酸酶的藥效學和藥代學性質。mPEG5k修飾尿酸酶與未修飾尿酸酶在體外血漿中都顯示出較好的降尿酸能力;未修飾尿酸酶在健康大鼠體內活性衰減半衰期hf≈12min,mPEG

8、修飾尿酸酶代謝半衰期約20小時。禽類體內缺乏內源性尿酸酶。mPEG修飾尿酸酶在雞體內有更長的活性衰減半衰期且可長時間維持體內血漿尿酸在較低水平。未修飾尿酸酶有很強免疫原性,在家兔體內抗尿酸酶IgG抗體滴度達到1:781250以上;大鼠體內,mPEG5k修飾尿酸酶的原有抗原反應活性大幅下降至5%以下,與兔抗尿酸酶抗體的抗原反應活性低于未修飾尿酸酶的10%,且出現(xiàn)了新的主要是針對mPEG的免疫原性。
　　 綜上所述,修飾劑結構性質、