阿霉素和白藜蘆醇共遞送PLGA納米粒的制備及其抗腫瘤活性評價.pdf

1、目的：
　　阿霉素（doxorubicin，DOX）對乳腺癌等腫瘤療效確切，價格低廉，但其毒副作用顯著，而且腫瘤細胞易對DOX產(chǎn)生耐藥，成為DOX臨床應用最常見和難以克服的問題。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為內(nèi)核，采用茴香酰胺-聚乙二醇-膽固醇連接物（AA-PEG-hyd-CHOL）對PLGA納米粒進行修飾，并將DOX和白藜蘆醇（resveratrol，RES）共同包封于PLGA納米粒中，得到阿霉素和白藜蘆醇共遞送P

2、LGA納米粒（NPS），使DOX和RES在體內(nèi)具有腫瘤靶向性，延長DOX和RES在體內(nèi)的循環(huán)時間，克服腫瘤細胞對DOX的耐藥，增強DOX的抗腫瘤作用，同時降低DOX對正常組織的毒性。
　　方法：
　　1.采用乳化溶劑揮發(fā)法制備表面修飾 AA-PEG-hyd-CHOL的共同包封 DOX和RES的PLGA納米粒（NPS），并用納米粒度及zeta電位分析儀和透射電鏡對納米粒進行表征。
　　2.采用熒光分光光度法研究NPS在不

3、同pH（pH5.0，pH6.5和pH7.4）緩沖液中釋放DOX和RES的動力學。
　　3.采用MTT實驗研究NPS、DOX、RES以及DOX和RES混合溶液（MIX）對MDA-MB-231細胞、MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞的細胞毒性；通過試劑盒檢測 NPS、DOX、RES以及 MIX對 MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞中Caspase-3活性的影響。
　　4.通過激光共聚焦

4、顯微鏡觀察 MDA-MB-231/ADR細胞和 MCF-7/ADR細胞對NPS、DOX、RES以及MIX的攝取，并觀察DOX和RES在MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞內(nèi)的分布。
　　5.采用流式細胞術(shù)以及 Western blot檢測 NPS、DOX、RES以及 MIX對MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞細胞周期以及周期相關蛋白表達的影響。
　　6.采用Western blot檢

5、測NPS、DOX、RES以及MIX對MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞凋亡相關蛋白以及耐藥相關蛋白表達的影響。
　　7.采用MTT實驗研究NPS、DOX、RES以及MIX對A549細胞的細胞毒性；采用Western blot檢測NPS、DOX、RES以及MIX對A549細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白表達的影響。
　　8.復制裸鼠MDA-MB-231/ADR細胞移植瘤模型，以腫瘤體積為指標，觀察NPS、D

6、OX、RES的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用活體成像儀觀察NPS遞送DOX和RES在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，采用熒光顯微鏡觀察NPS遞送DOX和RES在正常器官組織和腫瘤組織切片中的分布。對組織切片進行 H&E染色，觀察 NPS、DOX、RES對正常器官組織以及腫瘤組織形態(tài)的影響。對腫瘤組織內(nèi)的蛋白進行提取，觀察NPS對腫瘤組織中凋亡相關蛋白以及耐藥相關蛋白表達的影響。
　　9.復制裸鼠A549細胞移植瘤模型，以腫瘤體積為指標，觀察NPS、DO

7、X、RES的體內(nèi)抗腫瘤活性。采用活體成像儀觀察NPS遞送DOX和RES在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，采用熒光顯微鏡觀察NPS遞送DOX和RES在正常器官組織和腫瘤組織切片中的分布。對組織切片進行 H&E染色，觀察 NPS、DOX、RES對正常器官組織以及腫瘤組織形態(tài)的影響。
　　結(jié)果：
　　1. NPS的平均粒徑為（204±27）nm，zeta電位為（-15.8±0.8）mV，DOX和RES的載藥量分別為（4.6±1.4）％和（15

8、.5±5.3）%。
　　2. NPS釋放DOX和RES呈pH依賴性，當孵育時間為24h時，NPS在pH5.0的緩沖液中，DOX和RES的累積釋藥量分別達到了67.7%和81.4%；在pH7.4的緩沖液中，DOX和RES的累積釋藥量只有43.7%和43.6%。
　　3. NPS可劑量依賴性地抑制 MDA-MB-231細胞、MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞的生長；NPS可濃度依賴性地增加 MDA-MB-2

9、31/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞內(nèi)Caspase-3的水平。
　　4. NPS可時間依賴性地增加 DOX和 RES在 MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞核內(nèi)的蓄積。
　　5. NPS能夠顯著降低MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞細胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、CDK2以及CDK4的表達，誘導MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞發(fā)生G1期

10、阻滯。
　　6.NPS可顯著降低MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞中耐藥相關蛋白P-gp、MRP-1和BCRP的表達。此外，NPS還能夠顯著降低MDA-MB-231/ADR細胞和MCF-7/ADR細胞中凋亡相關蛋白NF-κB和BCL-2的表達，并且上調(diào)Bax的表達。
　　7. NPS可劑量依賴性地抑制A549細胞的生長，顯著降低A549細胞中細胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、CDK2以及

11、CDK4的表達，使細胞發(fā)生G1期阻滯。此外， NPS能夠顯著降低A549細胞中NF-κB和BCL-2蛋白的表達，并且上調(diào)Bax蛋白的表達。
　　8. NPS可劑量依賴性地抑制裸鼠 MDA-MB-231/ADR細胞移植瘤的生長。NPS可有效遞送RES和DOX于MDA-MB-231/ADR細胞移植瘤組織中，并減少RES和DOX在其他正常器官組織中的蓄積，尤其是DOX在心臟組織中的蓄積。H&E染色結(jié)果表明，NPS可顯著降低DOX的心臟毒

12、性。Western blot結(jié)果表明，與空白對照組相比，NPS可顯著降低腫瘤組織P-gp、BCRP、MRP-1、BCL-2以及NF-κB的表達，同時上調(diào)Bax和Caspase-3的表達。
　　9. NPS可有效遞送RES和DOX于A549細胞移植瘤組織中，劑量依賴性地抑制裸鼠A549細胞移植瘤的生長，減少RES和DOX在正常器官組織中的蓄積，尤其是DOX在心臟組織中的蓄積。H&E染色結(jié)果表明，NPS可顯著降低DOX的心臟毒性。