孤兒核受體Nur77在動脈粥樣硬化炎癥機制中的作用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是多種心血管危險因素及免疫機制共同參與的慢性炎癥性過程,是威脅人類健康的主要疾病。深入研究動脈粥樣硬化的病理分子機制,延緩斑塊的進展,使斑塊趨于穩(wěn)定,尋找有效地抗動脈粥樣硬化的靶點,一直是心血管病研究的熱點。
　　 氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)與巨噬細胞間存在交互式應(yīng)答,在動脈粥樣硬化開始,進展,斑塊的激活過程中起著關(guān)鍵性的作用。oxLDL是一種重要的促炎因子,能激活炎癥細胞,增加炎性因子的釋放,又是一種強烈的促

2、凋亡的因子,能誘導(dǎo)巨噬細胞的凋亡,繼發(fā)壞死,導(dǎo)致斑塊破裂,引起一系列臨床事件。激活的炎癥和巨噬細胞的凋亡是斑塊不穩(wěn)定的重要因素,因此,明確oxLDL激活的巨噬細胞中基因調(diào)控的分子機制具有及其重要的意義。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn),在巨噬細胞內(nèi),孤兒核受體Nur77能被多種炎癥刺激誘導(dǎo)表達,且在動脈粥樣硬化早期和進展期的病變內(nèi)Nur77呈較高表達,因此,Nur77可能是脂質(zhì)代謝,炎癥,動脈粥樣硬化中重要的調(diào)控因子。然而,Nur77是如何

3、參與動脈粥樣硬化的作用的,它的作用靶點,信號通路,調(diào)控后的細胞生理機制均不清楚,進一步闡明Nur77在動脈粥樣硬化及其炎癥過程中的作用,將為動脈粥樣硬化防治開辟新的思路。
　　 同時累積的證據(jù)表明,他汀類具有降低內(nèi)源性膽固醇以外的其他有益作用,如能抑制動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥細胞的增殖和活性,一系列臨床試驗也證實了他汀類在冠心病的一級,二級預(yù)防中的有效作用。然而,他汀的抗炎的機制并不明確。
　　 在本課題中,我們以體外培養(yǎng)

4、的巨噬細胞為研究對象,并分別建立了穩(wěn)定表達Nur77,Nur77-△DBD(deltaDBD,缺失DNA結(jié)合區(qū)域)的細胞系,以oxLDL作為炎癥刺激,擬從oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞的炎癥,凋亡的細胞模型中,探討孤兒核受體Nur77對巨噬細胞炎癥反應(yīng)及存活的調(diào)控作用及潛在的機制,擬為設(shè)計和開發(fā)新的抗動脈粥樣硬化藥物靶點提供初步的理論和實驗依據(jù)。同時,探討了在oxLDL激活的巨噬細胞中,他汀類藥物對Nur77表達的影響及對炎癥的調(diào)控機制,為他

5、汀類藥物的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　 第一部分孤兒核受體Nur77對巨噬細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控
　　 目的 oxLDL和巨噬細胞之間存在著交互式應(yīng)答,在動脈粥樣硬化疾病的開始,進展過程中起著關(guān)鍵性的作用。本研究探討了在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞中,Nur77對炎癥反應(yīng)的調(diào)控及其機制。
　　 方法： RAW264.7小鼠巨噬細胞常規(guī)體外培養(yǎng),以oxLDL作為炎癥刺激,用Real-time PCR和Western b

6、lotting技術(shù)檢測了Nur77表達；使用Western blotting方法檢測了MAPK信號通路；使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,G418篩選,建立了穩(wěn)定細胞系；siRNA技術(shù)knockdown Nur77表達；炎癥刺激后,Real-time PCR和Elisa法檢測炎癥因子的分泌；構(gòu)建了pGL3-COX-2啟動子,定點突變方法構(gòu)建了啟動子的突變體,瞬時轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測COX-2轉(zhuǎn)錄活性；Real-time PCR和Westernblott

7、ing方法檢測COX-2表達。
　　 結(jié)果：(1)oxLDL作為炎癥刺激,可以誘導(dǎo)Nur77mRNA和蛋白水平表達上調(diào)；(2)p38 MAPK信號通路抑制劑抑制了Nur77表達上調(diào)；(3)過表達Nur77,抑制了炎癥因子單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和腫瘤壞死因子(TNF)α的分泌,而Nur77-ADBD沒有抑制作用;(4)siRNAknockdown Nur77表達后,炎癥因子的分泌增加；(5)6-巰基嘌呤(6-MP)預(yù)處理細

8、胞后,減少了炎癥因子的分泌；(6)Nur77與pGL3-COX-2啟動子共轉(zhuǎn),抑制了COX-2的轉(zhuǎn)錄活性；而Nur77-△DBD沒有抑制作用；Nur77與啟動子突變體共轉(zhuǎn),也沒有抑制作用；(7)過表達Nur77抑制了COX-2 mRNA和蛋白水平表達；(8)siRNAknockdown Nur77表達后,COX-2 mRNA和蛋白表達增加；(9)6-MP預(yù)處理細胞后,抑制了COX-2的表達
　　 結(jié)論：(1)oxLDL可以誘導(dǎo)N

9、ur77表達,p38 MAPK信號通路參與了此過程的調(diào)控；(2)在激活的巨噬細胞中,Nur77通過抑制COX-2表達減少炎癥因子的分泌。
　　 第二部分孤兒核受體Nur77對巨噬細胞存活的調(diào)控
　　 目的oxLDL是動脈粥樣硬化斑塊進展的一個重要的誘導(dǎo)劑,高劑量oxLDL可以誘導(dǎo)細胞凋亡,斑塊破裂。本研究中,探討在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞凋亡中Nur77調(diào)控作用及其潛在機制。
　　 方法： MTT方法測定細胞活力

10、；oxLDL刺激細胞,用Western blotting方法檢測了MAPK信號通路；將細胞分為未刺激組,p38 MAPK通路抑制劑SB203580處理組,oxLDL刺激組,聯(lián)合刺激組,MTT方法測定細胞活力；Real-time PCR方法檢測了細胞周期相關(guān)的基因；流式細胞儀AnexinV法染色檢測細胞凋亡；細胞轉(zhuǎn)染過表達Nur77,炎癥刺激,BrdU Elisa方法檢測DNA合成；Real-time PCR方法檢測細胞周期相關(guān)基因PCN

11、A,p21及凋亡相關(guān)基因Caspase3的表達。
　　 結(jié)果：(1)巨噬細胞隨著oxLDL刺激濃度增加,細胞活力下降；(2)使用p38通路抑制劑SB203580預(yù)處理后,細胞活力下降,細胞增殖周期相關(guān)基因CyclinA2,PCNA表達下降,流式細胞儀證實了細胞凋亡比例增加；(3)過表達Nur77,細胞活力不下降,不影響DNA合成；(4)oxLDL刺激細胞后,細胞增殖周期相關(guān)基因PCNA表達下降,細胞周期抑制基因p21表達上調(diào),而

12、過表達Nur77細胞周期基因未見明顯變化；(5)過表達Nur77抑制凋亡基因Caspase3的表達。(6)siRNA knockdown Nur77表達后,明顯上調(diào)Caspase3基因的表達。
　　 結(jié)論：(1)Nur77在oxLDL刺激下可以被激活,p38 MAPK信號通路參與這一表達過程的調(diào)控,同時參與了細胞存活的調(diào)控。(2)Nur77參與了細胞周期相關(guān)的基因調(diào)控,抑制凋亡基因的表達,起到了促細胞存活的作用。
　　

13、第三部分阿托伐他汀對巨噬細胞炎癥調(diào)控機制中Nur77的作用
　　 目的：動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。累積的證據(jù)表明他汀類在降低膽固醇以外,還具有調(diào)控炎癥的作用。本研究探討了在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞中,阿托伐他汀對炎癥反應(yīng)調(diào)控機制中Nur77的作用。
　　 方法：oxLDL刺激細胞后,Real-time PCR方法檢測了COX-2 mRNA表達；Western blotting方法檢測了COX-2蛋白表達；用不同濃

14、度的阿托伐他汀預(yù)處理細胞后,給予或不給予oxLDL刺激,Westernblotting方法檢測了Nur77表達；Real-time PCR及Western blotting方法分別檢測了COX-2 mRNA及蛋白的表達；Western blotting方法檢測了ERK1/2 MAPK信號通路及IκBa表達；使用ERK1/2通路抑制劑PD98059預(yù)處理細胞后,分別用Real-time PCR和Western blotting方法檢測CO

15、X-2表達。
　　 結(jié)果：(1)oxLDL刺激細胞后,上調(diào)了COX-2 mRNA和蛋白表達；(2)給予不同濃度的阿托伐他汀預(yù)處理細胞后,Nur77表達呈劑量依賴性上調(diào)(3)給予不同濃度的阿托伐他汀預(yù)處理細胞后,抑制了COX-2mRNA和蛋白表達；(3)給予不同濃度的阿托伐他汀預(yù)處理細胞后,抑制了ERK1/2磷酸化,抑制了IκBa的降解；(4)給予PD98059預(yù)處理細胞后,抑制了COX-2 mRNA和蛋白表達。
　　 結(jié)

16、論：(1)oxLDL呈時間依賴性誘導(dǎo)了COX-2表達。(2)阿托伐他汀呈劑量依賴性上調(diào)了Nur77蛋白表達。(3)阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制了oxLDL誘導(dǎo)的COX-2表達。(3)其作用機制是通過上調(diào)Nur77表達及抑制了ERK1/2的磷酸化和IκBa的降解。
　　 總結(jié)：本研究以巨噬細胞為研究對象,對Nur77在巨噬細胞炎癥反應(yīng)和存活以及他汀在巨噬細胞炎癥中的調(diào)控及其分子機制進行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nur77在oxLDL炎癥刺激下

17、通過p38 MAPK信號通路被誘導(dǎo)表達；并參與激活的巨噬細胞中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)；機制研究表明Nur77通過抑制COX-2表達負向調(diào)控炎癥反應(yīng)。Nur77參與oxLDL誘導(dǎo)凋亡的巨噬細胞中細胞存活的調(diào)控；機制研究表明Nur77參與了細胞周期相關(guān)的基因調(diào)控,抑制凋亡基因的表達,起到了促細胞存活的保護作用。阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制了oxLDL誘導(dǎo)的COX-2表達；其作用機制是通過上調(diào)Nur77表達及抑制ERK1/2的磷酸化和IκBa的降解。本