重組人透明質(zhì)酸酶的工藝優(yōu)化及質(zhì)量研究.pdf

1、透明質(zhì)酸（ hyaluronic acid，HA）是一種高分子多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的必需組分。透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）是特異性降解HA的酶家族，廣泛存在于微生物和動(dòng)物組織中。HAase通過(guò)催化HA水解，降低HA黏度，可逆性地改變真皮結(jié)構(gòu)，從而提高組織通透性。因此，HAase已被用于提高與其聯(lián)用的其他藥物、藥劑和蛋白質(zhì)在組織間的分散和傳遞效率。
　　已進(jìn)入

2、臨床應(yīng)用的HAase主要有兩類，一類提取自哺乳動(dòng)物睪丸組織，一類是利用基因重組技術(shù)將人精子膜蛋白PH20在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)、純化制成的重組人透明質(zhì)酸酶（recombinant human hyaluronidase，rHuPH20）。
　　透明質(zhì)酸酶PH20有六個(gè)糖基化位點(diǎn)和五個(gè)二硫鍵，難以高效表達(dá)和規(guī)?；a(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)室具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)能力，使用生物反應(yīng)器進(jìn)行了若干次5L規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，探索rHuPH20培養(yǎng)和純化工藝

3、。本研究的目的是進(jìn)行rHuPH20的工藝優(yōu)化，建立適用于規(guī)?；苽涞募兓に嚕_定rHuPH20的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使其符合《中國(guó)藥典》要求。
　　首先，在文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)純化工藝，得到純度＞90％的目的蛋白。為了進(jìn)一步提高蛋白純度和收率，從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了工藝優(yōu)化：
　?。?）考慮到規(guī)模化生產(chǎn)的需要，引進(jìn)中空纖維柱處理發(fā)酵液，在不影響酶活性的前提下提高了處理效率；
　?。?）由于高流速季銨瓊脂糖凝膠柱（Q Sephar

4、ose fast flow，Q FF）填料可承受的流速比高載量季銨瓊脂糖凝膠柱（Q Sepharose XL，Q XL）填料高，為了在粗純階段對(duì)樣品進(jìn)行快速處理，改進(jìn)了Q柱層析的填料。由于Tris緩沖液在pH7.0時(shí)的緩沖能力比HEPES緩沖液低，為了保證目的蛋白所帶電荷在純化過(guò)程中不會(huì)因?yàn)閜H值改變發(fā)生歧化反應(yīng)，改進(jìn)了Q柱層析的緩沖液。最后，采用階梯梯度洗脫法優(yōu)化洗脫條件，提高了純化效果。
　?。?）初次制備時(shí)，高效苯基交聯(lián)瓊脂

5、糖凝膠柱（Phenyl high performance，Phenyl HP）層析的純化方式為流穿，不利于控制蛋白純化過(guò)程。高鹽濃度有利于蛋白質(zhì)與吸附劑結(jié)合，但高鹽可能改變酶的空間結(jié)構(gòu)，使酶永久性失活。因此，先進(jìn)行了(NH4)2SO4濃度耐受實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高了(NH4)2SO4濃度，成功將目的蛋白結(jié)合在層析柱上。然后，采用階梯梯度洗脫法優(yōu)化洗脫條件，提高了純化效果；
　?。?）由于陶瓷羥基磷灰石Ⅱ型（ceramic hyd

6、roxyapatite typeⅡ，CHTⅡ）層析柱對(duì)蛋白的吸附能力比Ⅰ型層析柱弱，蛋白表達(dá)量的提高，可能超出Ⅱ型層析柱的吸附能力；另外，目的蛋白等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）理論值為5.6，是一種酸性蛋白，Ⅰ型層析柱更適宜酸性蛋白純化，因此改用Ⅰ型層析柱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由于CHT柱填料羥基磷灰石會(huì)在層析過(guò)程中溶解，使層析柱失效，而磷酸鹽與少量鈣離子聯(lián)用，可充分抑制其溶解，因此，在磷酸鹽緩沖液中加入少量CaCl2抑制羥

7、基磷灰石溶解，延長(zhǎng)了層析柱使用壽命。為了避免由于無(wú)水磷酸鹽和水合磷酸鹽混用導(dǎo)致溶液中焦磷酸鹽含量不一致對(duì)層析過(guò)程的影響，統(tǒng)一了用于緩沖液配置的高階磷酸鹽水平。通過(guò)降低上樣溶液電導(dǎo)率，使目的蛋白與層析柱完全結(jié)合。最后，采用階梯梯度洗脫法優(yōu)化洗脫條件，提高了純化效果；
　?。?）由于高流速磺酸基瓊脂糖凝膠柱（SP Sepharose fast flow，SP FF）填料主要用于粗分離和中度純化階段，不適宜作為柱層析的最后一步，因此，改

8、用適用于精細(xì)純化的高效磺酸基瓊脂糖凝膠柱（SP Sepharose high performance，SP HP）。用階梯梯度洗脫實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了純化效果。
　　通過(guò)以上系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)建立了簡(jiǎn)便易行的層析工藝，得到的目的蛋白純度＞99.9%，N-端測(cè)序結(jié)果表明，目的蛋白N端氨基酸序列與理論序列一致。
　　在此基礎(chǔ)上，對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行了放大，能夠滿足原液和成品質(zhì)量研究的需求。
　　在制備工藝確立的基礎(chǔ)上，根據(jù)《中國(guó)藥

9、典》（2015版）Ⅲ部對(duì)重組生物制品的相關(guān)要求進(jìn)行了目的蛋白結(jié)構(gòu)確證和原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。主要內(nèi)容包括：純度、質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量（脫糖/非脫糖）、氨基酸序列覆蓋率、二硫鍵分析、活性、蛋白含量、比活性、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留、外源DNA殘留、等電點(diǎn)和蛋白N端序列等。
　　結(jié)果顯示：
　?。?）質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量、二硫鍵配對(duì)信息、等電點(diǎn)和N-端氨基酸序列與理論值一致；
　　（2）氨基酸序列覆蓋率、SDS-PAGE純度、SEC-HPL

10、C純度、HIC-HPLC純度、宿主細(xì)胞蛋白殘留和外源DNA殘留符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)；
　　本部分的研究成果還包括：
　?。?）建立了利用SEC-HPLC法檢測(cè)rHuPH20純度的方法，并對(duì)方法的專屬性、線性、重復(fù)性、中間精密度、檢測(cè)限、定量限和耐用性進(jìn)行了評(píng)估；
　?。?）優(yōu)化了透明質(zhì)酸酶活性檢測(cè)方法。在活性檢測(cè)中，使用牛血清白蛋白（BSA）與HA反應(yīng)，解決了藥典方法使用動(dòng)物血清帶來(lái)的批間差異問(wèn)題，也解決了實(shí)驗(yàn)室條件下