白楊素對氧化應激誘導的血管內(nèi)皮損傷的保護作用.pdf

1、目的：
　　1.觀察白楊素急性給藥是否可以減輕H2O2所致的HUVEC氧化應激損傷；
　　2.觀察白楊素是否可以減輕高糖導致的HUVEC損傷和改善高糖損傷的大鼠離體主動脈舒張反應性。
　　方法：
　　1.（1）培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），用H2O2（100~1000μM）處理2 h，通過MTT實驗及細胞培養(yǎng)液中LDH的檢測，觀察不同濃度H2O2對細胞活力及膜
　　穩(wěn)定性的影響，選取最適濃度作為造模濃

2、度；常規(guī)培養(yǎng)HUVEC細胞，分為正常對照組（control）、H2O2損傷組（H2O2）及不同濃度白楊素處理組（25μM、50μM、100μM），檢測各組細胞活力以及細胞膜穩(wěn)定性；（2）測定各組HUVEC細胞內(nèi)丙二醛（MDA）濃度和超氧化物歧化酶（SOD）活性；（3）用10μM DCEF-DA孵育HUVEC30 min，熒光顯微鏡拍照分析各組細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的量；（4）采用Griess法檢測各組細胞內(nèi)一氧化氮（NO）的釋放；（5

3、）采用比色法檢測各組HUVEC細胞內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）活性；（6）采用RT-PCR法檢測各組HUVEC細胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平；（7）采用Western Blot法檢測各組HUVEC細胞eNOS蛋白表達水平。
　　2.（1）培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），通過MTT實驗觀察不同濃度葡萄糖（11.1 mM、22.2 mM、33.3 mM、44.4 mM）對HUVEC細胞活力的影響并選擇適當濃度時間

4、建立高糖損傷模型；培養(yǎng)HUVEC細胞，分為正常糖濃度組（normal glucose, NG）、高糖組（high glucose, HG）、甘露醇對照組（mannitol, MNT）、白楊素干預組（25μM、50μM、100μM），檢測各組細胞活力；DCEF-DA預孵30 min，熒光顯微鏡拍照分析各組活性氧簇（ROS）量；通過Griess法檢測各組細胞內(nèi)皮釋放NO的功能；采用比色法測定各組HUVEC細胞內(nèi)NOS活性；（2）采用大鼠離體

5、主動脈血管環(huán)，通過檢測ACh誘導的內(nèi)皮依賴性舒張反應性觀察高濃度葡萄糖對血管內(nèi)皮的損傷作用以及白楊素的干預作用。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的H2O2（100~1000μM）處理2 h后，隨著H2O2濃度的升高HUVEC細胞存活率逐漸降低。當濃度達400μM時，細胞存活率為（65.73±4.06）％，與control組相比有顯著性差異（P<0.01）；
　　2.不同濃度白楊素（25μM、50μM、100μM）預處理1

6、2 h后，細胞存活率分別增至（71.94±4.68）％、（82.17±4.65）％、（86.24±3.44）％，在50μM、100μM時與H2O2損傷組相比具有顯著性差異（P<0.01）；
　　3. H2O2處理2 h后，細胞內(nèi)MDA含量升高，濃度為（8.23±0.09）μM；而SOD活力顯著降低，活性為（0.59±0.07）U/mgprot，與 control組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；白楊素（25μM、50μM、100

7、μM）預處理12 h后，MDA含量顯著降低，分別降至（7.91±0.09）μM、（7.65±0.16）μM、（7.63±0.18）μM，與H2O2損傷組相比有顯著性差異（P<0.01）；SOD活性與H2O2損傷組相比顯著升高，并且在濃度為50μM、100μM時有顯著性差異（P<0.01），分別為（0.79±0.06）U/mgprot和（1.37±0.04）U/mgprot；
　　4. H2O2處理2 h后，細胞內(nèi)ROS生成增多，而

8、不同濃度白楊素（25μM、50μM、100μM）預處理12 h后，與H2O2損傷組相比，ROS產(chǎn)生減少；
　　5. H2O2處理2 h后，細胞內(nèi)NO釋放量顯著降低，濃度為（9.09±0.55）μM，與control組相比有顯著性差異（P<0.01）；白楊素（25μM、50μM、100μM）預處理12 h后，NO釋放量與H2O2損傷組相比增加，并且在50μM、100μM時，有顯著性差異（P<0.01），釋放量分別為（10.97±0.

9、65）μM、（11.43±0.85）μM；
　　6. HUVEC細胞在H2O2處理2 h后，胞內(nèi)總一氧化氮合酶（TNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同時降低，活力分別為（0.81±0.01）U/mgprot、（0.05±0.05） U/mgprot；而誘導性一氧化氮合酶（iNOS）活性升高，活力為（0.82±0.16）U/mgprot，與control組相比具有顯著性差異（P<0.01）；而白楊素（25μM、50μM、1

10、00μM）預處理12 h后，胞內(nèi)總一氧化氮合酶（TNOS）活性升高，活力分別增至（0.97±0.10） U/mgprot、（1.09±0.12）U/mgprot和（1.12±0.13）U/mgprot，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同時升高，活力分別為（0.20±0.09）U/mgprot、（0.38±0.12）U/mgprot和（0.41±0.13）U/mgprot，而誘導性一氧化氮合酶（iNOS）活性降低，活力分別為（0.84±

11、0.09）U/mgprot、（0.70±0.10）U/mgprot和（0.71±0.03）U/mgprot，與H2O2
　　損傷組相比具有顯著性差異（P<0.01）；
　　7. RT-PCR檢測結(jié)果顯示，H2O2損傷2小時，HUVEC細胞黏附分子VCAM-1、ICAM-1的 mRNA增加，不同濃度白楊素預孵育12 h，HUVEC細胞內(nèi)粘附分子VCAM-1、ICAM-1的mRNA表達降低；
　　8. Western bl

12、ot實驗結(jié)果顯示，H2O2損傷2小時，HUVEC細胞eNOS蛋白表達量下降，不同濃度白楊素預處理HUVEC細胞12 h后，eNOS蛋白表達量增加，與H2O2損傷組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；
　　9.高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育48 h后，細胞存活率降為（82.56±3.97）%，與 NG組相比有顯著性差異（P<0.01）；而甘露醇對照組（MNT, glucose5.5mM+mannitol27.8 mM）

13、與NG組相比無顯著性差異；白楊素（25μM、50μM、100μM）預處理2 h后，細胞存活率顯著升高，分別為（103.40±4.78）%、（107.60±11.58）%和（121.80±7.40）%，與HG損傷組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.01）；
　　10.高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育48 h后，胞內(nèi)ROS增多，而白楊素（25μM、50μM、100μM）預處理2 h后，胞內(nèi)ROS減少；
　　11.高糖（HG

14、，glucose33.3 mM）孵育后，細胞內(nèi)NO含量降至（2.63±0.38）μM，與NG組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；而甘露醇對照組（MNT, glucose5.5 mM+mannitol27.8 mM）與NG組相比無顯著性差異；不同濃度白楊素預處理2 h后，胞內(nèi) NO含量增加，在濃度為50μM、100μM時與 HG損傷組相比有統(tǒng)計學差異（P<0.05），分別為（4.03±0.69）μM、（4.07±0.98）μM；
　

15、　12. HUVEC細胞在高糖（HG，glucose33.3 mM）孵育48 h后，胞內(nèi)總一氧化氮合酶（TNOS）和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同時降低，活性為（1.10±0.07） U/mgprot、（0.01±0.18）U/mgprot；而誘導性一氧化氮合酶（iNOS）活性升高，活性為（1.10±0.23）U/mgprot，與NG組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；MNT組與NG相比沒有顯著性差異；白楊素（25μM、50μM

16、、100μM）預處理后，胞內(nèi)總一氧化氮合酶（TNOS）活性升高，活性分別為（1.35±0.31）U/mgprot、（1.66±0.38） U/mgprot和（1.71±0.25）U/mgprot；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性同時升高，活性分別為（0.22±0.58）U/mgprot、（0.70±0.25）U/mgprot和（1.03±0.37）U/mgprot；而誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性降低，活性分別為（1.13±0.2

17、9）U/mgprot、（0.96±0.13）U/mgprot和（0.69±0.15）U/mgprot；與 HG損傷組相比具有統(tǒng)計學差異
　?。≒<0.05）；
　　13.大鼠離體主動脈血管環(huán)在高糖（HG, glucose44.4 mM）孵育4 h后，ACh誘導的內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱，Emax和EC50為（31.78±3.36）%，81.10μM，與NG組相比有顯著性差異（P<0.01）；而 SNP誘導的非內(nèi)皮依賴性舒張與