iTRAQ和SWATH技術在膝骨關節(jié)炎滑液蛋白質組學中的應用研究.pdf

1、目的:運用iTRAQ和SWATH定量質譜技術比較研究膝骨關節(jié)炎(KOA)、類風濕性關節(jié)炎(RA)以及半月板損傷患者關節(jié)滑液蛋白質譜的差異，尋找并初步明確KOA關節(jié)滑液中的特異性生物學標志，為該病的早期診治、療效監(jiān)測和預后評估提供可靠的、準確靈敏的實驗室參考指標，并進一步闡述其發(fā)病機制。
　　方法:
　　1.收集2014年6月-2014年9月在解放軍總醫(yī)院行關節(jié)置換的10例KOA患者與行關節(jié)鏡手術的10例半月板損傷患者(鏡下顯

2、示關節(jié)軟骨均正常)的滑液標本。KOA患者疾病嚴重程度分級采用Kellgren-Lawrence(KL)放射學分級標準，所有實驗組KOA患者均為KL4級。采用iTRAQ定量質譜技術分析比較KOA組和半月板損傷組的蛋白質譜，初步篩選組間差異蛋白，并對差異蛋白進行GO分析、COG分析和通路富集分析。
　　2.另收集行關節(jié)置換的10例KOA患者和10例RA患者以及行關節(jié)鏡手術的10例半月板損傷患者(鏡下顯示關節(jié)軟骨均正常)的滑液標本。根據(jù)

3、KL放射學分級標準，所有KOA和RA患者均為KL4級。采用SWATH定量質譜技術分析比較KOA組、RA組和半月板損傷組的蛋白質譜，篩選KOA組的特異性差異蛋白。對差異蛋白進行GO分析和通路富集分析，同時采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量分析部分具有潛在臨床意義的蛋白。
　　結果:
　　1.采用iTRAQ定量質譜技術分析比較KOA和半月板損傷患者關節(jié)滑液的蛋白質譜差異，共鑒定出71個具有統(tǒng)計學差異的蛋白，其中31個在KOA

4、滑液中表達上調，40個表達下調。GO分析提示:這些差異蛋白大部分來源于細胞外基質、細胞膜、細胞器和大分子復合物等細胞成分;其分子功能主要為結合、轉運、催化和調節(jié)活性等;主要參與對刺激的反應、生物過程的調節(jié)及代謝反應等生物過程。通路富集分析顯示較多差異蛋白富集于補體和凝集瀑布反應通路和細胞外基質-受體相互作用的生物過程。
　　2.采用SWATH定量質譜技術分析比較KOA、RA和半月板損傷患者關節(jié)滑液的蛋白質譜差異，組間兩兩對比結果如

5、下:①KOA組vs半月板損傷組:差異蛋白共計131個，93個表達上調，38個表達下調。其中，補體C1r在KOA中上調最為明顯，脂肪酸結合蛋白在KOA中下調最為明顯。②RA組vs半月板損傷組:差異蛋白共計185個，152個表達上調，33個表達下調。③KOA組vs RA組:差異蛋白共計139個，22個表達上調，117個表達下調。經統(tǒng)計學分析得:KOA滑液中特異性差異蛋白共計28個，17個表達上調，11個表達下調，其中，Dickkopf蛋白在

6、KOA滑液中特異性表達上調。KOA和RA中表達趨勢不一致的差異蛋白共計8個，3個在KOA中表達上調，RA中表達下調;5個在KOA中表達下調，RA中表達上調。對KOA滑液中131個差異蛋白進行GO分析提示:差異蛋白主要來源于細胞外基質、細胞膜、細胞質、分泌顆粒、脂蛋白復合物等成分;分子功能主要為酶活性、酶抑制劑活性、結合、轉運和調節(jié)活性等;主要參與對創(chuàng)傷的急性炎癥反應、補體的活化、免疫應答、對刺激的反應、細胞凋亡的調控、內穩(wěn)態(tài)的維持等生物

7、過程。通路富集分析提示補體和凝集瀑布反應、細胞外基質-受體間相互作用以及過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路是差異蛋白參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。經ELISA驗證，補體C1r、Dickkopf蛋白在KOA滑液中表達上調，且與病情嚴重程度呈正相關;脂肪酸結合蛋白在KOA滑液中表達下調，且與病情嚴重程度呈負相關。
　　結論:
　　1.作為非特異性的蛋白質組學方法，iTRAQ標記定量技術和SWATH非標記定量技術均具靈敏度