NCX-2D2抗體對哇巴因誘發(fā)正常及心力衰竭大鼠心律失常的抑制作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　建立哇巴因誘發(fā)正常和心力衰竭大鼠心律失常模型，觀察抗鈉-鈣交換體NCX-2D2抗體對模型大鼠心律失常的影響，并分析其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.哇巴因誘發(fā)成年大鼠離體和在體心臟心律失常模型的建立
　?。?）哇巴因誘發(fā)大鼠離體心律失常模型
　　健康SD大鼠，50 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,開胸游離心臟并且懸掛于Langendorff裝置上，進行主動脈逆行灌流，流速為8 mL

2、·min-1，觀察至少30 min待心電圖波形穩(wěn)定后使用給藥泵給藥，記錄心電圖。
　　實驗分組如下：
　?、僬φ战M：含2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺氏液灌流；
　?、?D2+CaCl2組：含10μg·ml-1 NCX-2D2抗體和2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺氏液灌流；
　　③ Oua+CaCl2組：含5μmol·L-1 Ouabain和2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺氏液灌流；<

3、br>　?、?D2+Oua+CaCl2組：含10μg·ml-1 NCX-2D2抗體、5μmol·L-1 Ouabain和2.5 mmol·L-1 CaCl2的臺氏液灌流。
　　心電圖記錄藥物干預后30 min內室性期前收縮個數，室速和室顫發(fā)生率及持續(xù)時間。
　　（2）哇巴因誘發(fā)麻醉大鼠心律失常模型
　　健康SD大鼠用30 mg·kg-1水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠置于鼠板上,連接固定肢體導聯。采用 BL-420F生物機

4、能實驗系統(tǒng)記錄大鼠Ⅱ導聯心電圖,連續(xù)觀察30 min心電圖無異常后尾靜脈給藥,記錄藥物干預后1 h內室性期前收縮的個數、室速和室顫持續(xù)時間及發(fā)生率。
　　2.大鼠心力衰竭模型的制備
　　取成年健康SD大鼠，隨機分為偽手術組和心衰組，術前禁飲禁食24 h，稱量大鼠體重，給予水合氯醛（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉。待大鼠麻醉后固定于鼠板上，脫去大鼠腹部的毛，于大鼠左脊肋角后縱向切口2 cm，鈍性分離暴露腹主動脈，以7號針針

5、頭與腹主動脈一起結扎，然后抽出針頭形成腹主動脈狹窄，關閉腹腔。偽手術組僅不結扎腹主動脈，其余操作均與心衰組相同。術后3天每天腹腔注射青霉素20萬單位預防感染。
　　3.超聲心動圖檢測及HE染色
　　于造模后12周進行檢測。超聲心動圖檢測以下指標：左室舒張末期內徑(LVIDd)、左室收縮末期內徑(LVIDs)、左室射血分數(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。HE染色觀察偽手術組和心衰組大鼠心肌組織形態(tài)學特點。心功能檢測完

6、畢的大鼠，開胸取心臟，置于提前預冷的4℃生理鹽水中，經主動脈灌流沖洗干凈殘存血液后，分離心房心室，浸泡于4％多聚甲醛固定液中，固定24小時后常規(guī)脫水，石蠟包埋，心室肌組織切片，厚度為5μm，經HE染色，然后鏡下觀察。
　　4.哇巴因誘發(fā)心力衰竭大鼠并發(fā)心律失常模型及心功能測定
　　取心力衰竭SD大鼠用水合氯醛（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，連接肢體導聯，記錄大鼠Ⅱ導聯心電圖；同時通過右頸總動脈插管

7、至左心室腔測定心功能，并經由頸總動脈心室插管給藥的方式給予哇巴因（0.4 mg·kg-1）制備心力衰竭大鼠并發(fā)急性心律失常模型，NCX-2D2抗體（40、60μg·kg-1）、胺碘酮（Amiodarone，3 mg·kg-1）分別于哇巴因注射前5分鐘經頸總動脈插管給予，觀察給藥后1h期前收縮次數、室速和室顫發(fā)生率、持續(xù)時間的變化；并同步記錄心率、左室最大收縮速率、左室最大舒張速率、左室舒張壓。
　　5.大鼠心室肌細胞急性分離

8、>　　取健康SD大鼠，50 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，頸動脈放血后，快速開胸取心臟，修剪后經主動脈逆行插管懸掛于 Langendorff灌流裝置上，以無鈣且100%氧氣的臺氏液灌流心臟8～10分鐘，灌注環(huán)境：恒壓（75 cmH2O）、恒溫（37℃），后改為膠原酶液（0.07-0.1 g·L-1）循環(huán)灌流15～20分鐘，觀測心臟肌組織變大、變軟，冠脈血管邊緣不清時迅速剪下左心室，用KB液快速沖洗后置于其中，眼科剪剪至2~3m

9、m3小塊，用玻璃吸管（尖端圓潤，以免損傷肌細胞）輕輕吹打3~5 min后即可。過濾，棄去殘留心臟組織，濾液置于KB液中保存，后將其置于常溫穩(wěn)定3小時后使用。
　　6.全細胞膜片鉗記錄
　　應用全細胞膜片鉗技術，在電壓鉗模式下記錄大鼠左心室肌細胞 L-型鈣電流（ICa-L），Na+/Ca2+交換電流（INa/Ca）；在電流鉗模式下記錄大鼠左心室肌細胞動作電位（AP），施加條件刺激（15 ms3Hz）誘發(fā)延遲后除極。
　　

10、結果：
　　1. NCX-2D2抗體對哇巴因誘發(fā)大鼠心律失常具有顯著抑制作用
　?。?）10μg·ml-1 NCX-2D2抗體可明顯抑制哇巴因誘發(fā)大鼠離體心臟心律失常的發(fā)生，在哇巴因組，在給藥30 min內100%大鼠發(fā)生室速，71.43%大鼠出現室顫，在給予10μg·ml-1 NCX-2D2抗體干預后，在觀察期（30 min）內大鼠室速和室顫發(fā)生率分別降低至28.5%和0，室速持續(xù)時間由（192.71±18.45）s縮短至

11、（11.85±20.27） s（P<0.05），室性期前收縮個數由303±26減少至78±7（P<0.05）。
　?。?）NCX-2D2抗體可明顯抑制哇巴因誘發(fā)麻醉大鼠心律失常的發(fā)生。在哇巴因組，在給藥后1小時內100%大鼠發(fā)生室速，62.5%大鼠出現室顫。在預先5分鐘給予60、80μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預后，在觀察期（1 h）內大鼠室速發(fā)生率分別降低為50%、37.5%，室速持續(xù)時間由（50.91±3.58）min

12、分別縮短至（4.29±4.78）、（0.14±0.21） min(P<0.05），大鼠室顫發(fā)生率分別降低為33.3%、0，60μg·kg-1 NCX-2D2抗體使室顫持續(xù)時間由（2.83±3.03）min縮短至（0.37±0.58）min（P<0.05）。經比較發(fā)現，80μg·kg-1 NCX-2D2抗體對哇巴因誘發(fā)心律失常的抑制作用與陽性對照組胺碘酮效果相似。
　　2.腹主動脈縮窄術后12周，大鼠心力衰竭模型制備成功
　　

13、由M型超聲心動圖及HE染色發(fā)現，大鼠腹主動脈縮窄術后12周，大鼠出現心力衰竭。M型超聲心動圖顯示，大鼠左室收縮末期內徑和左室舒張末期內徑均明顯增大，左室收縮末期內徑由（2.05±0.08）mm增大至（5.42±0.29）mm（P<0.05），左室舒張末期內徑由（5.25±0.19）mm增大至（7.59±0.36）mm（P<0.05）；左室射血分數由（92±1.37）%減小至（62±5.65）%（P<0.05），左室短軸縮短率由（58±2

14、.48）%減小至（30±2.85）%（P<0.05）。HE染色顯示，心力衰竭大鼠細胞排列紊亂，心肌細胞出現肥大，部分心肌組織出現纖維化。
　　3. NCX-2D2抗體對哇巴因誘發(fā)心力衰竭大鼠并發(fā)的心律失常具有顯著抑制作用
　　研究結果顯示，0.4 mg·kg-1哇巴因可明顯增強心力衰竭大鼠心功能，但同時誘發(fā)出嚴重的心律失常。預先給予40、60μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預后，哇巴因誘發(fā)心衰大鼠并發(fā)的心律失常被明顯抑制

15、，且大鼠心功能較心衰組明顯提高。在哇巴因組100%大鼠發(fā)生室速，66.7%大鼠發(fā)生室顫，在給予哇巴因前5 min給予40、60μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預后，在觀察期（1 h）內室速發(fā)生率分別降低至66.7%和33.3%，在給予哇巴因前5 min給予40、60μg·kg-1 NCX-2D2抗體干預后，室速發(fā)生率分別降低至66.7%和33.3%，室速持續(xù)時間由（1120.8±173.9）s分別縮短至（264.6±206.4）、（

16、8.6±13.5）s（P<0.05），室顫發(fā)生率分別降低至33.3%和16.7%，室顫持續(xù)時間由（22.50±24.31）s分別縮短至（3.70±6.10）、（1.50±3.67）s（P<0.05），室性期前收縮個數由1640±157分別降低至488±19和138±33（P<0.05）。經比較發(fā)現，60μg·kg-1 NCX-2D2抗體對室性期前收縮的抑制作用較陽性對照組胺碘酮明顯，對其他類型心律失常的抑制作用與陽性對照組胺碘酮相似，且

17、其心功能較心衰組大鼠明顯提高。
　　4. NCX-2D2抗體可部分逆轉哇巴因對大鼠單個心室肌細胞鈉-鈣交換電流（INa/Ca）的增大作用
　　在鉗制電位+50mV和-100mV時，哇巴因組心肌細胞INa/Ca分別為9.20±0.09和-11.42±0.27(pA/pF），與對照組4.25±0.05和-4.08±0.09(pA/pF）相比明顯增大（P<0.05）。在哇巴因存在的情況下聯合給予5μg·ml-1 NCX-2D2抗體

18、后，INa/Ca在+50mV和-100mV時的外向和內向電流分別降低至6.67±0.27和-7.42±0.26（pA/pF），均明顯低于哇巴因組（P<0.05），但仍未完全恢復至正常水平（P<0.05）。
　　5. NCX-2D2抗體可部分逆轉哇巴因對大鼠單個心室肌細胞L-型鈣電流（ICa-L）的增大作用
　　研究結果顯示，哇巴因組心肌細胞 ICa-L為-8.73±0.36(pA/pF），與對照組-6.30±0.53（pA/

19、pF）相比明顯增大（P<0.05）。在聯合應用5μg·ml-1 NCX-2D2抗體后，ICa-L降至-7.45±0.29（pA/pF），與哇巴因組相比明顯降低（P<0.05），但仍未完全恢復至正常水平（P<0.05）。
　　6. NCX-2D2抗體可顯著抑制哇巴因誘發(fā)的大鼠單個心室肌細胞延遲后除極
　　研究結果顯示，對照組和2D2抗體組均未出現延遲后除極（DADs）。哇巴因組大鼠單個心室肌細胞DADs發(fā)生率為83.33%，在