因寧片對甲亢性肝損害大鼠的保護作用及其機制研究.pdf

1、甲狀腺功能亢進癥(Hyperthyroidism,簡稱甲亢),是一種常見的內分泌系統(tǒng)疾病,常累及全身多系統(tǒng)、多器官,其中常見而又往往易被忽視的是肝臟損害。甲亢性肝損害的發(fā)病率高達37％～76.7％,相當多的甲亢患者伴有肝臟損害,引起肝功能異常、肝腫大,黃疸等。肝臟是人體重要的代謝器官,肝損害引起肝細胞損害、再生、肝纖維化,并可以發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭。因此,關于肝損害機制及對其保護和治療藥物的研究就顯得非常迫切,已經引起許多學者的關注

2、,成為目前國內外研究的熱點與難點課題。甲亢性肝損害的治療,多以控制甲亢臨床癥狀為主,而保肝、降酶,避免肝臟進一步損害的治療藥物較少。因此,我們試圖研究既抗甲亢又保肝的中藥制劑以填補其空白。因寧片是南方醫(yī)院運用益氣養(yǎng)陰軟堅散結原理組成的,既治療甲亢,控制甲亢癥狀和體征,尤其是治療或減少甲亢并發(fā)癥、降低副作用、減少甲亢復發(fā)方面具有明顯優(yōu)勢,又有保肝作用的中藥制劑。實驗室前期研究證明因寧片能明顯降低大鼠血液中甲狀腺激素含量、延長甲亢小鼠耐缺氧

3、時間、提高小鼠非特異性免疫功能,但因寧片治療甲亢防治肝損害的作用機制尚不清楚,有待進一步研究。因此,本課題通過動物和細胞實驗,從受體和細胞水平,探討因寧片治療甲亢性肝損害的分子作用機制,為藥物開發(fā)和臨床應用提供實驗依據。
　　 第一章、因寧片對甲亢性肝損害大鼠模型的實驗研究
　　 目的:觀察因寧片對甲亢性肝損害大鼠模型的作用,檢測血清中甲狀腺激素水平、肝功能、氧化應激參數的變化,觀察肝臟病理組織學改變,探討氧化應激對甲亢

4、性肝損害的影響,為進一步研究藥物作用機制提供實驗依據。
　　 方法:選用SD雌性大鼠60只,隨機分為6組,除空白對照組外,其余大鼠給L-甲狀腺素鈉800μg/kg·d)灌胃30 d,制備甲亢性肝損害模型。大鼠造模成功后給予因寧片低(0.6g/(kg·d))、中(1.2 g/(kg·d))、高(2.4g/(kg·d))劑量,甲亢靈(1.2g/(kg·d))灌胃治療30 d,處死大鼠后收集血樣和肝組織,采用放射免疫法測定血清中三碘甲

5、腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)含量,全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平,分光光度法測定肝組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)值和Na+-K+-ATP酶活性。取肝臟進行光鏡和電鏡觀察。
　　 結果:
　　 (1)血清中T3、T4、TSH值

6、的變化:與空白對照組比較,模型組大鼠血清中T3、T4顯著升高,TSH顯著降低(P<0.01)。因寧片低、中、高劑量組與模型組比較均顯著降低T3、T4含量、升高TSH含量(P<0.05,P<0.01)。
　　 (2)血清中AST、ALT、ALP含量的變化:與空白對照組比較,模型組大鼠血清AST、ALT、ALP含量顯著升高(P<0.01)。因寧片低、中、高劑量組與模型組比較均能顯著降低AST、ALT含量(P<0.05,P<0.01)

7、,因寧片高劑量組能降低ALP水平(P<0.05),而因寧片低、中劑量組ALP水平無顯著性改變(P>0.05)。
　　 (3)肝組織MDA、SOD、GSH-Px、CAT、GSH值和Na+-K+-ATP酶活性的變化:模型組肝臟氧化應激指標中:MDA增加(P<0.01)； SOD、CAT、GSH—Px、Na+-K+-ATP酶活性降低,GSH含量下降,與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。與模型組比較,因寧片治療后,MDA含量降

8、低,呈現劑量依賴性(r=0.449,P<0.01)；因寧片低劑量升高SOD酶活性作用與因寧片中、高劑量比較有顯著性差異(P<0.01),但因寧片中劑量和高劑量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；因寧片低劑量升高CAT酶活性與高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05),而與中劑量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；因寧片升高GSH-Px、Na+-K+-ATP酶活性,增加GSH含量(P<0.05),因寧片各劑量組之間無顯著性差異。

9、　　 (4)肝臟光鏡和電鏡病理組織學改變:模型組大鼠肝細胞出現不同程度的脂肪變性、炎性細胞浸潤、線粒體數量增多、嵴消失等；因寧片各治療組能不同程度改善肝臟病理學變化:糖原顆粒明顯增多、線粒體數量減少、腫脹減輕、體積減小。
　　 結論:因寧片對L-甲狀腺素鈉誘發(fā)的大鼠甲亢性肝損害有明顯保護作用,能降低模型大鼠血液中甲狀腺激素水平,降低轉氨酶含量,改善肝臟病理損害,抑制肝臟氧化應激反應。
　　 第二章、因寧片對甲亢性肝損害

10、大鼠肝臟的甲狀腺激素受體、Ⅰ型脫碘酶和細胞色素P450基因表達的影響
　　 目的:運用實時熒光定量PCR方法檢測因寧片治療大鼠甲亢性肝損害后,肝臟的甲狀腺激素受體(TR)、Ⅰ型脫碘酶(DioI)和細胞色素P450(CYP450)基因表達的變化。
　　 方法:利用雌性大鼠灌服L-甲狀腺素鈉建立甲亢性肝損害大鼠模型。以甲亢靈為陽性對照藥,因寧片低、中、高劑量治療30d,取部分肝臟通過實時熒光定量PCR方法檢測肝組織內TRα1

11、、TRα2、TRβl、DioI、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2基因轉錄水平的變化。
　　 結果:
　　 (1)肝組織TRα1、TRα2、TRβ1表達變化:與空白對照組比較,模型組TRα1表達上調,TRα2表達下調,TRβ1表達上調(P<0.01)；因寧片能降低TRα1和TRβ1基因表達(P<0.05),對TRα2表達影響不明顯(P>0.05)。
　　 (2)肝組織DioI表達變化:模型組DioI表達與空

12、白對照組相比顯著增強(P<0.01),因寧片能降低DioI表達,并呈劑量依賴趨勢(r=-0.792,P<0.01。
　　 (3)肝組織CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2表達變化:與空白對照組比較,模型組CYP1A2和CYP3A2表達下降(P<0.01,P<0.05),而CYP2E1表達升高(P<0.01)；因寧片能降低CYP2E1的表達(P<0.05),但對CYP1A2和CYP3A2的表達無明顯影響(P>0.05)。

13、>　　 結論:因寧片能調節(jié)甲亢大鼠肝臟TR、DioI和CYP450基因的異常表達,這可能是因寧片治療甲亢性肝損害的分子作用機制之一。
　　 第三章、因寧片對甲亢性肝損害大鼠肝細胞凋亡的影響
　　 目的:觀察因寧片對甲亢大鼠肝細胞凋亡調節(jié)蛋白Fas、Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B細胞白血病-淋巴瘤-2(Bcl-2)表達的影響,探討因寧片對甲亢性肝損害的保護

14、作用及其機制。
　　 方法:利用雌性大鼠灌服L-甲狀腺素鈉建立甲亢性肝損害動物模型。以甲亢靈為陽性對照藥,因寧片低、中、高劑量組治療30d,取部分肝臟,采用免疫組化技術檢測各組大鼠肝臟中Fas、FasL、TNF-α的表達,Western-Blot檢測Caspase-3、Bcl-2蛋白表達。
　　 結果:
　　 (1)肝臟中Fas、FasL、TNF-α表達變化:Fas、FasL免疫反應陽性產物呈棕黃色,主要表達于細

15、胞漿中,TNF-α免疫反應陽性產物呈棕黃色,主要表達于細胞漿,細胞膜和炎細胞中；空白對照組有散在少量表達,模型組表達明顯增高,范圍增大,兩者比較有非常顯著性差異(P<0.01)。同模型組比較,因寧片中、高劑量組能下調Fas、FasL、TNF-α表達(P<0.05)。
　　 (2)肝臟中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達變化:與空白對照組比較,模型組Caspase-3蛋白表達升高,Bcl-2蛋白表達下降(P<0.01),因寧片

16、低、中、高劑量組能降低Caspase-3蛋白表達、升高Bcl-2蛋白表達,與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01)。
　　 結論:Fas、FasL、TNF-α、Caspase-3和Bcl-2在甲亢性肝損害大鼠的肝臟中表達異常,因寧片防治甲亢性肝損害的作用可能與抑制細胞凋亡有關。
　　 第四章、因寧片減輕T3誘導BRL肝細胞損害的體外實驗研究
　　 目的:觀察因寧片對T3誘導后BRL肝細胞的增值、肝功能和氧化應

17、激的影響,為進一步闡明藥物作用機制提供實驗依據。
　　 方法:
　　 (1)藥物血清的制備:25只雌性SD大鼠,隨機分為5組:空白對照組,因寧片低、中、高劑量組,甲亢靈組。大鼠灌服相應劑量的藥物后,腹腔靜脈采血,分離藥物血清。
　　 (2)因寧片對T3誘導BRL肝細胞損害的影響:建立大鼠肝細胞T3損害模型,在不同濃度因寧片藥物血清作用下,應用MTT法測定藥物作用后細胞存活率的變化,全自動生化分析儀測定培養(yǎng)上清液中

18、AST、ALT的含量,分光光度法測定細胞內MDA、SOD值。
　　 結果:
　　 (1)BRL細胞存活率的變化:隨著因寧片血藥濃度升高,T3損害后的BRL細胞存活率逐漸增加；因寧片低劑量組與中劑量組比較有顯著性差異(P<0.05),高劑量組和中劑量組比較有升高趨勢但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 (2)BRL細胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST含量的變化:與模型組比較,因寧片能顯著減少ALT、AST的釋放(P<0

19、.05),因寧片中劑量組和低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),因寧片高劑量組與因寧片中劑量組比較有降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 (3)BRL細胞內MDA、SOD含量的變化:模型組BRL細胞混懸液中的MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低,和空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較,甲亢靈組和因寧片中、高劑量組均能明顯降低MDA含量(P<0.05),因寧片低、中、高劑量組能顯著