NR4A1基因的克隆及真核表達載體的構建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:克隆小鼠孤兒核受體(NR4A1)基因全長cDNA的讀碼框，構建攜帶NR4A1基因的重組真核表達載體，為研究其在心肌細胞中的功能做準備。
　　 方法:從Pax-8敲除的小鼠心肌組織提取總RNA，通過逆轉錄得到總cDNA，利用逆轉錄PCR法擴增，將目的產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，測序分析正確后，再以相同PCR方法擴增，將其與真核表達載體pIERS2-ZsGreen1連接，構建重組質粒。經(jīng)限制性酶切及測序鑒定后，利用L

2、ipofectamine2000將重組載體pIERS2-ZsGreen1-NR4A1轉染到H9C2心肌細胞。實驗分三組:①PZ-NR4A1組:細胞轉染1.2μg pIERS2-ZsGreen1-NR4A1重組載體;②NC組:細胞轉染1.2μgpIERS2-ZsGreen1空載體;③BC組:給予的常規(guī)培養(yǎng)液，未做其他處理。并用RT-PCR法和Western blotting法檢測轉染后NR4A1 mRNA和蛋白的表達。
　　 結果

3、:成功構建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表達載體。轉染重組載體到細胞后，相比BC組（1.00±0.00）和NC組（0.99±0.16），PZ-NR4A1組（2.62±0.21）NR4A1 mRNA表達水平明顯升高(P＜0.05)，而BC組和NC組mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PZ-NR4A1組（0.72±0.11）NR4A1蛋白的表達量與BC組（0.17±0.07）和NC組（0.21±0.08）

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