轉(zhuǎn)AtMYB12基因提高馬鈴薯中綠原酸含量的研究.pdf

1、馬鈴薯是世界上重要的蔬菜作物和第四大糧食作物，屬于茄科。‘魯引1號(hào)’是山東省農(nóng)科院由荷蘭引進(jìn)的馬鈴薯栽培品種，具有早熟、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在山東省內(nèi)得到廣泛的種植。綠原酸是一種多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基，抑菌抗病毒和保護(hù)心血管等生物活性，馬鈴薯栽培品種中僅有少量的綠原酸存在，且不同品種之間差異性比較大。
　　 馬鈴薯是同源四倍體，應(yīng)用雜交育種的方法改良品種比較困難。馬鈴薯可以通過(guò)塊莖無(wú)性繁殖，將轉(zhuǎn)基因特性傳遞給后

2、代無(wú)需經(jīng)過(guò)花培的純化或多代的選育，因此利用基因工程技術(shù)培育新的品種有較大的優(yōu)勢(shì)。研究證明轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可以提高植物中次生代謝物的含量，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系也日趨成熟。本研究通過(guò)高效液相色譜和質(zhì)譜法檢測(cè)到轉(zhuǎn)AtMYB12基因的馬鈴薯‘Desiree’中綠原酸的含量明顯提高，含量為1.095-4.846 mg/g DW.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯莖段轉(zhuǎn)化法將擬南芥中的類黃酮調(diào)控因子AtMYB12基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯栽培品種‘

3、魯引1號(hào)’中。獲得PCR陽(yáng)性植株25株，陽(yáng)性率32％。
　　 利用高效液相色譜測(cè)定馬鈴薯中綠原酸的含量，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯‘魯引1號(hào)’塊莖中綠原酸的含量為1.613-3.693mg/g DW，與非轉(zhuǎn)基因相比含量提高近20倍.因轉(zhuǎn)基因安全性問(wèn)題備受爭(zhēng)議，本研究中選用cre/lox位點(diǎn)特異性重組體系將轉(zhuǎn)基因株系中的標(biāo)記基因NPTⅡ剔除掉，研究中選擇了2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了選擇標(biāo)記基因的剔除，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行β-雌二醇的誘導(dǎo)處理，β-雌二醇的

4、濃度定為5μM，處理后經(jīng)NPTⅡF/R、CREF/R與AtMYB12F/R等特異性引物PCR分析，PCR結(jié)果表明β-雌二醇誘導(dǎo)產(chǎn)生NPTⅡ重組缺失的概率為4％.
　　 無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因AtMYB12的‘魯引1號(hào)’塊莖中綠原酸的含量為1.766-3.748mg/gDW，與非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯相比綠原酸含量有非常顯著的提高，轉(zhuǎn)基因塊莖提取物的氧化抗性與對(duì)照相比提高2倍，抑菌試驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因塊莖提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用與非轉(zhuǎn)基因塊莖相比更加

5、明顯。對(duì)苯丙烷代謝途徑上相關(guān)基因DFR、FLS和HQT的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，三個(gè)基因的表達(dá)量均上升，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中FLS基因的表達(dá)量與對(duì)照相比提高23倍;DFR基因的表達(dá)量提高17倍;HQT基因表達(dá)量提高的倍數(shù)最大，達(dá)到60倍。研究結(jié)果與預(yù)期相符，目標(biāo)基因被完整的轉(zhuǎn)入到馬鈴薯品種‘魯引1號(hào)’中，且標(biāo)記基因NPTⅡ被剔除.
　　 綜上所述，我們通過(guò)轉(zhuǎn)基因的策略使得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系中綠原酸的含量提高，并使得轉(zhuǎn)基因塊莖提取物的氧化抗性及