加味茵陳四逆湯預防給藥對肝纖維化幼鼠TGF-β1-Smads通路的影響.pdf

1、肝纖維化是一個可逆的創(chuàng)傷修復反應，也是所有慢性肝臟損傷的必經(jīng)通路。隨著疾病負擔日益下降，年輕患者中出現(xiàn)門靜脈高壓的后遺癥、肝衰竭和肝硬化相關肝細胞癌的越來越多。全球疾病負擔預測肝硬化和肝細胞癌占到全球所有死亡人數(shù)的2.5％，肝移植是唯一有效治療失代償性肝病的方法;然而，北美和歐洲已出現(xiàn)供體器官短缺的情況，這一現(xiàn)象導致等待肝臟移植患者的死亡率增加約20％。不僅僅成人會出現(xiàn)肝纖維化，嬰幼兒也很常見。膽道閉鎖在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病約1/5000～1

2、/19000，而亞洲國家發(fā)病率比歐洲國家更高。膽道閉鎖肝纖維化是一種普遍和突出的疾病特點，其肝纖維化進展速度明顯超過其他肝膽疾病，90天以上的患兒已不宜行肝門腸吻合術（Kasai術），需要行肝移植才能長期生存;嬰兒肝炎綜合征是一組嬰兒期（包括新生兒期）起病的臨床癥候群，以黃疸、肝臟病理體征（肝腫大、質地異常）和肝功能損傷為特征。由于致病因素的持續(xù)作用和機體免疫功能失調，肝細胞直接受損或免疫損傷，纖維組織不斷增生，肝臟組織漸漸由炎癥受損階

3、段過渡到肝纖維化階段，以膠原蛋白、蛋白多糖及粘連蛋白等多種細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝內過度沉積為其主要病理變化。目前肝纖維化研究較多且較為關鍵的信號通路即為TGF-β1/Smads信號通路，藥物阻斷或干預TGF-β1/Smads信號通路能有效影響或遏制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)藥物大多數(shù)針對成人肝纖維治療，小兒用藥少之又少，以及早且有效干預、毒副作用小為目標，人們將研究目光轉投中醫(yī)藥，希冀從中醫(yī)藥當

4、中探尋到防治肝纖維化的有效藥物。
　　本課題組在前期臨床研究已表明加味茵陳四逆湯對小兒膽道閉鎖Kasai術后治療可改善臨床癥狀、延緩術后肝纖維化的發(fā)生、提高患兒的生存質量;細胞實驗證明了加味茵陳四逆湯對肝星狀細胞的TGF-β1/Smads信號通路方面有一定作用，但加味茵陳四逆湯的藥物療效和作用機理尚留有空白。同時，本研究也是國家自然科學基金項目“加味茵陳四逆湯對膽道閉鎖小鼠肝纖維化模型TGF-β1/Smads通道及MMPs/TIM

5、Ps的影響研究（課題編號:81373686）”的部分內容。
　　目的:
　　觀察加味茵陳四逆湯對四氯化碳誘導肝纖維化幼鼠模型的預防干預作用，研究其對臟器指數(shù)、肝臟病理組織學及血清學指標的影響，并從TGF-β1/Smads信號通路方面探索其可能的作用機制。
　　方法:
　　將42只Wistar雄性幼鼠隨機分為空白組、溶劑對照組、模型組、秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高劑量組、加味茵陳四逆湯中劑量組、加味茵陳四逆湯低劑量

6、組，每組6只。除空白組、溶劑對照組外，其余各組幼鼠均腹腔注射0.15ml/kg50％CCl4，溶劑對照組幼鼠腹腔注射0.15ml/kg橄欖油，均為每周2次，連續(xù)21天。溶劑對照組和模型組每日給予滅菌水10ml/kg灌胃，秋水仙堿組每日給予秋水仙堿0.1mg/kg灌胃;加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組每日分別予加味茵陳四逆湯16.46g/kg、8.23g/kg、4.12g/kg灌胃;空白組不做任何處理，每日1次給藥，給藥周期21天。于實驗第

7、22天進行腹主動脈取血和提取肝臟、脾臟樣本。將提取肝臟和脾臟于電子天平稱重，測定肝、脾指數(shù);通過HE染色觀察肝臟情況，采用Ishak評分系統(tǒng)了解肝纖維化程度;以賴式微板法檢測血清ALT、AST水平;通過競爭性抑制酶聯(lián)免疫吸附測定血清HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ含量;采用RT-qPCR檢測TβRI mRNA、Smad3mRNA、Smad7 mRNA、CollagenⅠ mRNA、CollagenⅢ mRNA的表達;采用Wester

8、n Blot檢測TβRI、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表達。
　　結果:
　　1.加味茵陳四逆湯對肝指數(shù)和脾指數(shù)的影響
　　與空白組相比，模型組肝指數(shù)、脾指數(shù)明顯升高（P＜0.05），溶劑對照組肝指數(shù)、脾指數(shù)無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組肝指數(shù)、脾指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。
　　2.加味茵陳四逆湯對肝組織的影響

9、>　　(1)空白組和溶劑對照組幼鼠肝小葉結構完整，輪廓清晰，匯管區(qū)及其周圍未見小膽管及纖維組織增生。模型組肝小葉結構被破壞，甚至消失，肝索排列紊亂，匯管區(qū)大量增生的纖維，呈條索狀，從匯管區(qū)伸向相鄰的匯管區(qū)形成纖維橋連并分割肝實質，肝間質有大量炎細胞浸潤。秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組存在肝小葉結構不清晰，肝細胞可見腫脹和明顯脂肪變性，肝間質有炎細胞浸潤，而且匯管區(qū)都有不同程度的肝纖維化表現(xiàn)，但纖維化程度均較模型組有明顯的減輕

10、。
　　(2)空白組和溶劑對照組沒有纖維化發(fā)生（P＞0.05）;模型組與空白組比較病理評分顯著升高（P＜0.05）;秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、中、低劑量組與模型組比較病理評分明顯降低（P＜0.05）。
　　3.加味茵陳四逆湯對血清ALT、AST的影響
　　與空白組相比，模型組ALT、AST顯著性升高（P＜0.05），溶劑對照組ALT、AST無明顯差異(P＞0.05);與模型組相比，秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高、中、

11、低劑量組ALT明顯降低(P＜0.05)，而各用藥組AST無顯著性差異（P＞0.05）。
　　4.加味茵陳四逆湯對血清HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ的影響
　　與空白組相比，模型組HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ顯著升高（P＜0.05），溶劑對照組各指標無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，除加味茵陳四逆湯低劑量組HA、LN無顯著性差異（P＞0.05）外，各用藥組HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ明顯降低（P＜

12、0.05）。
　　5.加味加味茵陳四逆湯對Tβ RI mRNA、Smad3 mRNA、Smad7mRNA、CollagenⅠ mRNA、CollagenⅢ mRNA表達的影響
　　(1)與空白組相比，模型組Tβ RI mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05），溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、中劑量組Tβ RI mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05），加味茵陳四逆湯低劑量

13、組無明顯差異(P＞0.05)。
　　(2)與空白組相比，模型組Smad3 mRNA相對表達量明顯升高(P＜0.05)，溶劑對照組無明顯差異(P＞0.05);與模型組相比，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯中劑量組Smad3 mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05），加味茵陳四逆湯高、低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。
　　(3)與空白組相比，模型組和溶劑對照組Smad7 mRNA相對表達量無顯著性差異（P＞0.05）;與模型組相

14、比，加味茵陳四逆湯中劑量組Smad7 mRNA相對表達量明顯降低(P＜0.05)，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、低劑量組無明顯差異（P＞0.05）。
　　(4)與空白組相比，模型組CollagenⅠ mRNA相對表達量明顯升高(P＜0.05)，溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，加味茵陳四逆湯中劑量組CollagenⅠ mRNA相對表達量顯著降低(P＜0.05)，秋水仙堿組和加味茵陳四逆湯高、低劑量組無明顯差異(P

15、＞0.05)。
　　(5)與空白組相比，模型組CollagenⅢ mRNA相對表達量明顯升高（P＜0.05），溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，秋水仙堿組、加味茵陳四逆湯高、中劑量組CollagenⅢ mRNA相對表達量顯著降低(P＜0.05)，加味茵陳四逆湯低劑量組無明顯差異(P＞0.05)。
　　6.加味茵陳四逆湯對TβRI、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達的影響<

16、br>　　(1)與空白組相比，模型組TβRI蛋白相對表達量升高（P＜0.05），溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，各用藥組TβRI蛋白相對表達量無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2)與空白組相比，模型組Smad3蛋白相對表達量顯著升高(P＜0.05)，溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，加味茵陳四逆湯中、低劑量組Smad3蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）。
　　(3)與空白組相比，

17、模型組Smad7蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）:與模型組相比，各用藥組Smad7蛋白相對表達量無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(4)與空白組相比，模型組CollagenⅠ蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），溶劑對照組無明顯差異（P＞0.05）;與模型組相比，各用藥組CollagenⅠ蛋白相對表達量無顯著性差異（P＞0.05）。
　　(5)與空白組相比，模型組Collage

18、nⅢ蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05），溶劑對照組無明顯差異(P＞0.05);與模型組相比，加味茵陳四逆湯中劑量組CollagenⅢ蛋白相對表達量明顯降低(P＜0.05)。
　　結論:
　　加味茵陳四逆湯高、中、低三個劑量對CCl4誘導的肝纖維化幼鼠預防給藥能不同程度上減輕幼鼠肝臟炎癥和纖維化程度以及脾臟癥狀。加味茵陳四逆湯可降低ALT、HA、LN、IV-C、PCOL-Ⅲ，同時HA、LN的變化與藥物濃度存在相關性。提示加