鋅指轉錄因子Slug招募LSD1在乳腺癌轉錄下調ERα的表達.pdf

1、背景與目的：乳腺癌是嚴重威脅女性身心健康的疾病，雖然其新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)呈逐年遞增趨勢，但是隨著人們對乳腺癌認識的逐漸深入和治療方法的不斷優(yōu)化，死亡率無明顯上升。在乳腺癌中,雌激素受體α（ERα）不僅是分子分型的生物標記、內分泌治療的靶點，也參與到乳腺癌的上皮間質轉化（EMT）和侵襲轉移的過程，被認為是乳腺癌重要的預后因子。ERα的缺失是三陰性乳腺癌的重要特征之一，此種類型的乳腺癌易于發(fā)生復發(fā)和轉移，缺乏有效的靶向治療，臨床預后較差

2、。乳腺癌中ERα缺失的機制是近年來的研究熱點。Slug是具有鋅指結構的Snail超家族成員之一，在多種腫瘤中都可以轉錄抑制E-鈣粘素（E-cadherin）的表達，是促進 EMT的重要上游分子。賴氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）是在2004年首先發(fā)現(xiàn)的賴氨酸特異性去甲基化酶，當它和不同的轉錄因子結合后可以影響組蛋白不同位點賴氨酸的甲基化水平，發(fā)揮上調或者下調下游靶基因的作用。在本論文中，主要研究了Slug與 Erα的表達關系，Slug

3、調控Erα的機制，Slug/LSD1復合物對Erα的調控作用，以及Slug、LSD1對乳腺癌細胞生物學功能的影響。
　　材料和方法：
　　1)用免疫組化的方法在50例乳腺癌標本中分析了Slug及Erα的表達情況，然后分析了The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據庫中Slug及Erα的mRNA和蛋白表達水平，驗證免疫組化的結果。同時利用該數(shù)據庫分析了Slug與臨床病理參數(shù)的相關性。利用在線網站 http:

4、//kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast分析了 Slug對預后的影響。
　　2)利用免疫印跡法、熒光實時定量PCR（RT-PCR）分別研究了在乳腺癌細胞株（MCF-7, T47D, MDA-MB-231, BT549, SKBR3）中Erα及Slug的蛋白和mRNA表達水平；采用免疫印跡法、RT-PCR和免疫熒光實驗研究了在Erα陽性乳腺癌細胞株 MCF-7、T

5、47D和 Erα陰性乳腺癌細胞株中 MDA-MB-231、BT549中Slu g對Erα的調控作用。
　　3)利用雙熒光素酶報告基因實驗研究了Slug對ESR1啟動子活性的影響。用染色質免疫共沉淀（ChIP）的方法探究了Slug在ESR1啟動子的結合情況，進一步用ChIP-熒光定量PCR（qPCR）的方法定量研究在MDA-MB-231及其穩(wěn)定敲除Slug的細胞株MDA-MB-231shSlug，Slug在ESR1啟動子結合情況的變

6、化。
　　4)利用免疫印跡法、RT-PCR的方法分別在MCF-7和MDA-MB-231研究了LSD1單獨以及Slug和LSD1聯(lián)合對Erα的調控作用。在HEK293T和 MDA-MB-231細胞中用免疫共沉淀的方法探究了Slug和LSD1的結合情況及Slug的SNAG區(qū)域對于此結合的重要性。用ChIP-qPCR研究了在干擾Slug后LSD1在ESR1啟動子的結合情況變化。用LSD1的作用底物H3K4me2行組蛋白ChIP-qPCR

7、探究LSD1對Erα組蛋白的甲基化水平的影響。
　　5)用劃痕愈合實驗，細胞增殖，遷移侵襲，平板克隆形成實驗探討了 Slug和LSD1單獨及聯(lián)合對MDA-MB-231生物學功能的影響。
　　結果：
　　1)在50例乳腺癌標本中，免疫組化結果示Slug與Erα負相關。TCGA數(shù)據庫示：在mRNA水平，Erα陰性的病人，Slug平均表達水平高；而Erα陽性的病人，Slug平均表達水平低；在蛋白水平，可以得到類似的結論。通過

8、Pearson’s R檢驗發(fā)現(xiàn)兩者的相關系數(shù)在mRNA水平為-0.1612，在蛋白水平為-0.3403。Slug和年齡、腫瘤大小、淋巴結累及情況、AJCC分期、轉移情況、human epidermal growth factor receptor2（HER-2）狀態(tài)無關，但是和ER、孕激素受體（PR）、分子分型高度相關：Slug高表達組，ER、PR表達水平低，基底型乳腺癌的比例高；Slug低表達組，ER、PR表達水平高，基底型乳腺癌的比

9、例低。通過分析Kaplan-Meierplots生存數(shù)據庫，發(fā)現(xiàn)在總體乳腺癌和Erα陽性亞組乳腺癌中，Slug mRNA水平與無復發(fā)生存（RFS），無遠處轉移生存（DMFS）沒有相關性；在Erα陰性亞組乳腺癌中，Slug高表達組的RFS、DMFS低，即易于發(fā)生復發(fā)和遠處轉移。
　　2)在MCF-7、T47D、MDA-MB-231、BT549、SKBR3乳腺癌細胞中，Slug和ERαmRNA和蛋白表達水平均呈負相關。在 Erα陽性的

10、乳腺癌細胞株MCF-7和 T47D中梯度過表達Slug引起Erα的下調；在Erα陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231和BT549中干擾 Slug引起Erα的上調。熒光雙標顯示，在MCF-7和T47D中過表達Slug時，細胞核區(qū)域出現(xiàn)代表Slug的紅色熒光，而該相應區(qū)域代表Erα的綠色熒光減弱；在MDA-MB-231中干擾Slu g時，細胞核區(qū)域紅色熒光減弱，而該相應區(qū)域綠色熒光增強。
　　3)雙熒光素酶實驗顯示：在 MDA-MB

11、-231細胞株中，當梯度干擾 Slug時，ESR1 promoter1-luc和ESR1 promoter2-luc的活性逐漸上升，但ESR1 promoter3-luc活性無明顯變化；在MCF-7和MCF-7Slug細胞株中可以看到相類似的結果。ChIP結果顯示Slug能和ESR1啟動子上第1、3、4和6個潛在結合位點結合。
　　4)在MCF-7中，單獨干擾LSD1，引起Erα的下調，同時過表達Slug和干擾LSD1時，Erα的

12、下調更明顯；在 MDA-MB-231中，單獨干擾LSD1，引起Erα的上調，同時干擾Slug和LSD1時，Erα的上調更明顯。在HEK293T和 MDA-MB-231細胞中，免疫共沉淀顯示Slug與LSD1結合形成復合物，且Slug的SNAG區(qū)域對于此結合至關重要。ChIP-qPCR顯示當干擾Slug時，LSD1在ESR1啟動子上的結合會變弱；當干擾LSD1時，ESR1組蛋白的H3K4二甲基化水平會升高。
　　5)在MDA-MB-