基于全基因組測序的多灶性甲狀腺乳頭狀癌克隆相關關系研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　近年來，包括我國在內的多個國家和地區(qū)流行病數據均顯示甲狀腺癌發(fā)病率不斷攀升，為廣大患者以及醫(yī)療體系帶來了嚴重的負擔。甲狀腺癌中最常見的亞型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，約占80％-85％左右。據文獻報導PTC常表現為多灶性，即同一個甲狀腺內可見多個腫瘤病灶。然而，針對這一常見的臨床現象背后不同病灶之間的克隆相關關系目前尚無令人滿意的研究方法。
　　新

2、一代測序技術的出現和普及將腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥機制以及預后監(jiān)控等各個方面的研究都推進到了前所未有的一個層面。全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)是新一代測序技術中代表性的一種應用。隨著技術的發(fā)展，完成單個樣本全基因組測序所需的時間和成本逐年降低，使其具有用于科研甚至推廣至臨床檢測的可行性。
　　本研究旨在①對本大學附屬第一醫(yī)院甲乳外科近2年來甲狀腺乳頭狀癌患者病歷資料進行統(tǒng)計分析，總結出多灶發(fā)生率以

3、及多灶性甲狀腺乳頭狀癌(multifocalpapillary thyroid carcinom，mPTC)所伴隨的臨床特點;②通過收集mPTC病例手術切除標本并分別對不同病灶進行全基因組測序，利用生物信息學分析方法分析點突變、插入缺失突變、拷貝數變異和結構變異等信息，判斷不同病灶間克隆相關關系。
　　研究方法:
　　收集2013年1月至2015年5月期間就診于本大學附屬第一醫(yī)院甲乳外科PTC患者的臨床信息，對患者年齡、性別

4、、腫瘤病灶數量、主要病灶最大直徑、病灶位置、合并其他病癥以及轉移情況等臨床特征進行綜合統(tǒng)計和分析，以篩選出男、女性患者中mPTC獨特的臨床特點。
　　經患者知情同意后，收集mPTC患者術前外周血以及手術切除甲狀腺癌灶及癌旁組織，經病理確認病灶性質后對各癌灶進行基因組DNA提取，經過建庫和質控后利用Hiseq X Ten進行測序。在基本掌握WGS數據生物信息分析方法的基礎上，從質控、過濾、比對、體細胞突變、驅動突變以及異質性和克隆進

5、化等方面完成對測序數據的分析，從而對病灶間克隆相關關系進行分析。此外，采用Sanger測序和免疫組化對驅動突變BRAF V600E進行確證。
　　研究結果:
　　第一部分研究中，共統(tǒng)計分析了2013年1月至2015年5月期間920名PTC患者的臨床信息，其中636名女性患者、284名男性患者，平均年齡為45.69±12.68歲。在所有這920名患者中，323名患者(35.1％)經病理確診為多灶患者，即甲狀腺內存在至少2個癌灶

6、。經統(tǒng)計分析發(fā)現，男性和女性患者mPTC患者中發(fā)生淋巴結轉移的比例顯著高于單灶PTC(男性中47.8％ vs.25.8％，P＜0.001;女性中31.3％ vs.22.1％，P=0.01)，女性患者中mPTC比單灶PTC的主要腫瘤直徑要大(P＜0.001)，此外，女性患者單灶PTC中伴隨非癌結節(jié)比例要顯著高于mPTC(P＜0.001)。
　　第二部分研究中，共計完成對3名mPTC患者（編號為mPTC_ P1-P3）的8個癌灶以及對

7、應3個生殖系對照進行了WGS（腫瘤樣本目標測序深度為50X;對照樣本目標測序深度為30X），共計獲得1897 Gbases的測序數據。經過全基因組范圍克隆級別單核苷酸變異(single nucleotide variant，SNV)位點和頻率的比較，發(fā)現mPTC_P1和mPTC_P2不同病灶間克隆關系為克隆獨立型（即不同癌灶獨立成瘤），而mPTC_P3不同病灶間克隆關系為克隆同源型（即不同癌灶是腺內轉移形成）。WGS、Sanger測序和

8、免疫組化均顯示著8個癌灶有BRAFV600E突變。對于克隆同源型的mPTC_P3，其中的淋巴結轉移灶與原發(fā)灶相比，不僅共有3個外顯子區(qū)域突變，而且還攜帶2個獨有的外顯子區(qū)域突變。在mPTC_P3的3個癌灶均可見22號染色體短臂存在拷貝數缺失變異。突變特征分析還發(fā)現與AID/APOBEC活性有關的13號特征和2號特征存在于mPTC_P3的2個病灶中。對克隆突變分發(fā)現5/8個癌灶中可見瘤內異質性。克隆演化分析發(fā)現mPTC_P3的淋巴結轉移的

9、發(fā)生屬于早期事件。
　　研究結論:
　　①PTC發(fā)生多灶的情況較為常見，本研究中920名PTC病例的多灶發(fā)生率為35.1％。
　?、趍PTC具有獨特的臨床表現特征，包括比單灶甲狀腺乳頭組癌(sPTC)具有更高的淋巴結轉移發(fā)生率（男性中47.8％ vs.25.8％，P＜0.001;女性中31.3％ vs.22.1％，P=0.01）;女性患者中mPTC比sPTC的主要腫瘤直徑要大(P＜0.001)，此外，女性患者sPTC中