脂多糖協(xié)同多聚左旋精氨酸誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌IL-6、IL-8的JNK信號(hào)通路研究.pdf

1、目的：
　　研究脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）協(xié)同多聚左旋精氨酸（Poly-L-arginine, PLA）誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞分泌白介素-6（interleukin-6, IL-6）和IL-8的信號(hào)通路機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　用常規(guī)培養(yǎng)基（10％胎牛血清+90%RPMI1640培養(yǎng)液）體外培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞，置于37℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，根據(jù)細(xì)胞

2、生長(zhǎng)狀態(tài)，一般每3-4天傳代1次。取最佳生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，以約3×105/500μl的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。
　　2. Western Blot檢測(cè)JNK磷酸化水平
　　按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將NCI-H292細(xì)胞分為PLA（5μg/ml）組、LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+LPS（5μg/ml）組，每組刺激時(shí)間分別為0、15min、30min、45min、60min、90min、120min，采用Weste

3、rn Blot檢測(cè)各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的JNK、p-JNK蛋白含量，以β-actin作內(nèi)參，并分析比較不同時(shí)間點(diǎn)的p-JNK/JNK比值；將 NCI-H292細(xì)胞分為空白對(duì)照組、PLA（5μg/ml）組、LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+LPS（5μg/ml）組，采用Western Blot檢測(cè)比較各組細(xì)胞內(nèi)的JNK、p-JNK蛋白含量，并比較JNK信號(hào)通路特異性抑制劑SP600125（30μM）作用前后對(duì)JNK磷酸化的

4、影響。
　　3. ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-8
　　按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將NCI-H292細(xì)胞分為空白對(duì)照組、PLA（5μg/ml）組、LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+LPS（5μg/ml）組、PLA（5μg/ml）+SP600125（30μM）組、LPS（5μg/ml）+SP600125（30μM）組、PLA（5μg/ml）+LP

5、S（5μg/ml）+SP600125（30μM）組和SP600125（30μM）組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組要求先加入JNK信號(hào)通路特異性抑制劑SP600125，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，預(yù)先刺激2h后，再加入PLA或/和LPS。共同培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒檢測(cè)各組的IL-6和IL-8表達(dá)情況，比較各組間存在的差異。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理、分析實(shí)驗(yàn)

6、數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用-x±s表示，單因素方差分析（One-Way ANOVA）用于多組間的比較；LSD（least significant difference）檢驗(yàn)用于兩兩間比較方差齊時(shí)，方差不齊時(shí)采用Dunnett,s T3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. PLA作用NCI-H292細(xì)胞一定時(shí)間（15min、30min、45min、60min、90min、120min）后 JNK磷酸化水平均增加，與空

7、白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均<0.01），且JNK磷酸化隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，45min達(dá)到高峰（P<0.001）后下降。
　　2. LPS作用時(shí)間為15min、30min、45min、60min、90min、120min時(shí)，JNK磷酸化水平較空白對(duì)照組均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），與 PLA類(lèi)似的是45min之前呈上升趨勢(shì)，45min為JNK磷酸化高峰（P<0.01），45min后為下降趨勢(shì)。
　　3. PL

8、A+LPS作用NCI-H292細(xì)胞15min、30min、45min、60min、90min、120min， JNK磷酸化水平較空白對(duì)照組顯著增加，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P均<0.001）， PLA+LPS的作用高峰提前至30min（P<0.01），45min時(shí)較前下降（P<0.001），在60min時(shí)再次增加后減少（P<0.001），30min的JNK磷酸化水平高于60min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4. PLA+

9、LPS組的JNK磷酸化水平顯著高于PLA組或LPS組，PLA+LPS組與PLA組、LPS組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）。
　　5. SP600125能明顯減少PLA或/和LPS刺激NCI-H292細(xì)胞的JNK磷酸化水平增加（P均<0.001）。
　　6.與空白對(duì)照組比較，PLA組、LPS組和PLA+LPS組的NCI-H292細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-8的表達(dá)明顯增加（P均<0.01），并且PLA+LPS組明顯高于

10、PLA組或LPS組（P均<0.001）；SP600125能明顯抑制PLA組、LPS組和PLA+LPS組的NCI-H292細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8（P均<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1. PLA、LPS能激活NCI-H292細(xì)胞內(nèi)的JNK信號(hào)通路，并且兩者具有協(xié)同效應(yīng)。
　　2. LPS能協(xié)同PLA促進(jìn)NCI-H292細(xì)胞分泌IL-6和IL-8。
　　3. JNK信號(hào)通路參與LPS協(xié)同PLA誘導(dǎo)NCI-H292