肝星狀細胞內(nèi)TGM2與TLR4信號通路間的正反饋調(diào)節(jié)促進日本血吸蟲感染引起的肝纖維化.pdf

1、研究背景與目的：
　　肝纖維化可由病毒感染、酒精、膽管結(jié)扎和四氯化碳等引起，日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，Sj）感染導(dǎo)致的肝纖維化是日本血吸蟲病的主要病理變化。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。TLR4（Toll-like receptor4）信號通路的活化在肝纖維化中發(fā)揮著重要作用，特別是肝星狀細胞中TLR4信號通路的活化，但是TLR4通路信號

2、與Sj感染所致肝纖維化的關(guān)系及其機制不明。我們已經(jīng)報道了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（transglutaminase2，TGM2）在Sj感染所致肝纖維化中起重要作用。因此，本研究的目的是鑒定在肝星狀細胞內(nèi)的TGM2和TLR4信號通路之間的調(diào)控關(guān)系、以及該調(diào)控在Sj感染所致肝纖維化的作用。
　　研究方法：
　　1.日本血吸蟲感染所致肝纖維化動物模型的建立：日本血吸蟲尾蚴通過腹部皮膚貼片法對BALB/c小鼠（健康6-8周齡、SPF級、雌性）

3、進行感染，于感染后的第0、5、6、8和12周收集標本。
　　2.天狼星紅染色法對日本血吸蟲感染所致肝纖維化動物模型的鑒定：使用Abcam公司的天狼星紅試劑盒及其說明書進行。
　　3.對日本血吸蟲感染小鼠使用TLR4信號通路阻斷劑 TAK242：在小鼠感染 Sj后第4周開始使用，腹腔注射法，2次/周，0.3mg/kg體重/只鼠，連續(xù)注射4周。在感染后第8周收集標本。
　　4.對日本血吸蟲感染小鼠使用TGM2抑制劑胱胺：在

4、小鼠感染Sj后第3天開始使用，連續(xù)7天，腹腔注射法，濃度10-2mmol/L，100μL/只小鼠，每天注射1次。在感染后第8周收集標本。
　　5.動物標本的收集與處理：在相應(yīng)時間點，收集各葉肝臟，分別進行總RNA提取、總蛋白和石蠟包埋等處理。
　　6.肝星狀細胞株的培養(yǎng)：肝星狀細胞株購買于上海細胞所。用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)。
　　7. RNA表達水平的半定量檢測：Trizol法提取組織/細胞總R

5、NA，繼而用primeScript RT Master Mix試劑盒按說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用SYBR Green II PCR Master kit對α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Collagen I、Collagen III、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2（TGM2）、CD14、腫瘤壞死因子（TNF）-α、pro-IL-1β以及干擾素誘導(dǎo)蛋白（IP）-10、T細胞表達和分泌因子調(diào)節(jié)活化蛋白（RANTES）等的RNA表達水平進行半定量檢測。<

6、br>　　8.蛋白表達水平檢測：使用Western blotting法和免疫組織化學(xué)染色結(jié)合H-score半定量法。
　　9.蛋白質(zhì)表達的細胞定位：采用免疫熒光檢測法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察及后續(xù)的Image J軟件分析法。
　　研究結(jié)果：
　　1. TLR4信號通路活化的關(guān)鍵分子的水平與日本血吸蟲感染后5、6、8周的肝臟組織中膠原表達水平和α-SMA的表達水平一致；
　　2.用TAK242抑制TLR4信號通路的

7、活化，Sj感染8周肝臟組織的膠原表達水平和α–SMA水平隨之下降；
　　3. Sj感染的肝臟和體外培養(yǎng)的HSC株中都顯示 TLR4和α–SMA可共定位，并且該共定位的程度隨著TAK242的使用而降低。
　　4.對Sj感染肝臟和體外培養(yǎng)的HSC細胞株使用TAK242抑制脂多糖（LPS）刺激的TLR4信號通路活化，TGM2的水平隨之降低。
　　5.對Sj感染肝臟和體外培養(yǎng)的HSC細胞株使用胱胺抑制TGM2的活性，LPS刺激