膽堿能抗炎通路在右美托咪定抗心肌缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、背景：心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指短時(shí)間內(nèi)心肌組織缺血出現(xiàn)組織損傷，而當(dāng)恢復(fù)血供時(shí)心肌缺血性損傷更為嚴(yán)重的現(xiàn)象。常見(jiàn)于心臟手術(shù)、冠脈搭橋、臟器血供梗塞后再通等情況，這種損傷阻礙心肌從再灌注中獲得修復(fù)，成為臨床上的一個(gè)主要難題。心肌缺血再灌注損傷常常伴隨出現(xiàn)機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和組織損傷，其機(jī)制包括活性氧族爆發(fā)、鈣超載、心肌能量代謝障礙、中性粒細(xì)胞激活、炎性因子釋放和細(xì)胞凋亡等，MIRI的過(guò)程也就是炎癥反應(yīng)不斷加劇、持續(xù)惡化的過(guò)程

2、。
　　許多學(xué)者做了關(guān)于 MIRI保護(hù)方面的研究。有研究發(fā)現(xiàn)膽堿能抗炎通路(CAP)可能是MIRI的保護(hù)機(jī)制之一。CAP一條異于傳統(tǒng)體液抗炎的免疫調(diào)節(jié)通路，它通過(guò)迷走神經(jīng)和乙酰膽堿進(jìn)行免疫調(diào)控，進(jìn)而起到抗炎作用。與傳統(tǒng)體液抗炎機(jī)制相比，CAP通過(guò)內(nèi)源性的神經(jīng)反饋調(diào)節(jié)來(lái)達(dá)到調(diào)控炎癥反應(yīng)、減輕炎癥損害的作用，具有更快速、更易控的特點(diǎn)，因而在調(diào)控MIRI的炎癥反應(yīng)中更具優(yōu)勢(shì)。
　　右美托咪定是一種新型高選擇性α2-腎上腺素能受體激

3、動(dòng)劑，在重癥監(jiān)護(hù)病房及臨床麻醉中被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定對(duì)肺、腎等器官損傷具有保護(hù)作用，可減少細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明，右美托咪定對(duì)心臟損傷也有一定的保護(hù)作用，包括減輕心肌缺血再灌注損傷、穩(wěn)定心律等，而且可降低心臟手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生。右美托咪定有興奮迷走神經(jīng)，減慢心率的作用，同時(shí)又有抗炎作用，這些藥理特性，與CAP作用于神經(jīng)中樞，興奮迷走神經(jīng)，起到抑制炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)極為相似。另外，右美托咪定作為一種中樞鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛

4、藥，作用靶點(diǎn)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，本課題以大鼠缺血再灌注心肌為模型，并結(jié)合臨床樣本資料進(jìn)行研究分析，探討CAP對(duì)缺血再灌注損傷心肌的作用及右美托咪定的干預(yù)作用。
　　目的：通過(guò)構(gòu)建大鼠心肌缺血再灌注模型及研究分析臨床樣本資料，探討CAP對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。為闡明右美托咪定在缺血再灌注損傷心肌中的作用及其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分右美托咪定對(duì)心肌缺血再灌注的保護(hù)作用
　　1、大鼠

5、心肌缺血再灌注模型：取健康大鼠60只隨機(jī)分為四組，每組15只。第一組為假性手術(shù)組；第二組為心肌缺血再灌注模型（對(duì)照組），缺血前靜脈注射生理鹽水預(yù)處理10 min；第三組為心肌缺血再灌注模型（Dex組），缺血前靜脈注射右美托咪定預(yù)處理10 min。第四組為心肌缺血再灌注模型（實(shí)驗(yàn)組），缺血前靜脈注射右美托咪定預(yù)處理10 min，且切斷迷走神經(jīng)。動(dòng)物麻醉后，于左股動(dòng)脈處置管以記錄血壓，并于四肢皮下插入針形電極導(dǎo)出心電圖。通過(guò)冠脈結(jié)扎法給予心

6、臟缺血處理，30 min后進(jìn)行再灌注，再灌注時(shí)間為180 min。血壓記錄顯示降低20 mmHg且心電圖顯示S-T段升高表示缺血成功；血壓及心電圖逐漸恢復(fù)表示再灌注成功。再灌注結(jié)束后抽取血清，并快速取左室心肌組織。
　　2、心肌組織采用甲醛固定、石蠟包埋與切片處理，通過(guò)伊紅-蘇木素（HE）染色觀察心肌形態(tài)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等，并計(jì)算心梗面積。
　　3、比色法檢測(cè)心肌組織與血漿中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量。

7、>　　4、采用ELISA法測(cè)定各組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量。
　　5、研磨心肌組織提取蛋白。免疫印跡（western blot）方法檢測(cè)組織中凋亡因子bcl-2、bax、caspase-3及信號(hào)分子α7 nAChR、p65、I?B-?的表達(dá)。
　　第二部分膽堿能抗炎通路介導(dǎo)右美托咪定抗心肌缺血再灌注損傷的研究
　　1、構(gòu)建T鈣通道高表達(dá)與低表達(dá)慢病毒載體，分別經(jīng)鞘內(nèi)注射轉(zhuǎn)染。將T鈣通道高

8、表達(dá)與低表達(dá)大鼠分別輸注右美托咪定（Dex組）和生理鹽水（對(duì)照組），注藥后利用腦片檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化和乙酰膽堿活性。
　　2、取20只T鈣通道高表達(dá)大鼠與20只T鈣通道低表達(dá)大鼠進(jìn)行心肌缺血再灌注，并分別在缺血再灌注時(shí)注射右美托咪定（Dex組）和生理鹽水（對(duì)照組），每組10只。檢測(cè)各組心肌損傷指標(biāo)：心梗面積；血漿中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量；血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量。

9、　　3、取30只大鼠分為3組，對(duì)照組10只不做處理，低a7nAcha組10只使用a7nAch受體拮抗劑a-銀環(huán)蛇毒素處理，高a7nAch組10只使用a7nAch受體激動(dòng)劑GTS-21處理。3組大鼠進(jìn)行心肌缺血再灌注，且均進(jìn)行10min的右美托咪定預(yù)處理。檢測(cè)各組心肌損傷指標(biāo)：心梗面積；血漿中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量；血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量。
　　4、LPS誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞炎癥，

10、si-RNA沉默α7 nAChR。檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的 RNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；并檢測(cè)p65、bcl-2、bax等因子表達(dá)。
　　第三部分右美托咪定對(duì)臨床心肌缺血再灌注損傷患者的保護(hù)作用
　　選取2013年3月-2014年8月治療的64例CABG手術(shù)患者，對(duì)其臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將病人分為兩組，實(shí)驗(yàn)組為手術(shù)時(shí)進(jìn)行注射右美托咪定，對(duì)照組則注射生理鹽水處理。分別于入室時(shí)、主

11、動(dòng)脈開(kāi)放后0 min(T1)、15 min（T2）、2 h（T3）和24 h（T4）檢測(cè)記錄病人平均動(dòng)脈壓(MAP)和心率(HR)，并采集病人血清。比色法檢測(cè)血清中cTnI和CK-MB含量，ELISA法測(cè)定血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的含量。
　　結(jié)果：
　　1、右美托咪定對(duì)大鼠心肌缺血再灌注組織損傷的保護(hù)作用
　?。?）組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示：右美托咪定處理后，由心肌缺血再灌注引起的心肌組織損傷明顯減

12、輕，組織形態(tài)相對(duì)完整、組織細(xì)胞凋亡壞死減少、且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕、心梗面積明顯減少。
　　（2）右美托咪定處理后，心肌缺血再灌注大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的水平明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。
　?。?）右美托咪定處理后，心肌缺血再灌注大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。
　?。?）右美托咪定處理后，心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中促凋亡因子bax、凋

13、亡蛋白caspase-3的表達(dá)明顯下降，而抗凋亡因子bcl-2的表達(dá)明顯上升。
　　2、膽堿能抗炎通路介導(dǎo)右美托咪定抗炎抗心肌缺血再灌注損傷中的研究。
　?。?）心肌缺血再灌注模型中右美托咪定處理但切斷迷走神經(jīng)的大鼠其抗心肌缺血再灌注損傷作用明顯減弱（心梗面積較 Dex組增大；LDH、CK含量較Dex組上升； TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的水平較Dex組上升）。
　?。?）心肌缺血再灌注模型中右美托咪定

14、處理但切斷迷走神經(jīng)的大鼠心肌組織中α7 nAChR、I?B-?的表達(dá)明顯下調(diào)， p65的表達(dá)明顯上升（較Dex組）。
　?。?）大鼠中T鈣通道高表達(dá)，可起到與右美托咪定處理類似的提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及增強(qiáng)乙酰膽堿活性的作用；而當(dāng)大鼠中 T鈣通道低表達(dá)，則可明顯減弱右美托咪定處理引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升及乙酰膽堿活性增強(qiáng)。
　　（4）大鼠中T鈣通道高表達(dá)，可起到與右美托咪定處理類似的抗缺血再灌注損傷作用；而當(dāng)大鼠中 T鈣通道

15、低表達(dá)，則可明顯減弱右美托咪定的抗缺血再灌注損傷作用。
　?。?）使用 a7nAch受體拮抗劑 a-銀環(huán)蛇毒素處理的大鼠，右美托咪定的抗心肌缺血再灌注損傷作用明顯減弱（心梗面積較Dex組增大；LDH、CK含量較Dex組上升；TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的水平較Dex組上升）；使用a7nAch受體激動(dòng)劑GTS-21處理的大鼠則可與右美托咪定處理起到同樣的抗心肌缺血再灌注損傷作用。
　?。?）在乳鼠心肌細(xì)胞中使用

16、LPS誘導(dǎo)炎癥，沉默α7 nAChR后，發(fā)現(xiàn)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的水平明顯上調(diào)；細(xì)胞凋亡比例明顯上升；促凋亡因子bax、凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)明顯下降，而抗凋亡因子bcl-2的表達(dá)明顯上升；NF-κB信號(hào)通路分子 p65的表達(dá)明顯上調(diào)，NF-κB信號(hào)通路抑制分子I?B-?的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　3、右美托咪定對(duì)臨床病人心肌缺血再灌注的保護(hù)作用
　?。?）相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組患者M(jìn)AP和

17、HR處于較為正常水平。
　?。?）相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組血清中cTnI和CK-MB含量較低。
　?。?）相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的含量較低。
　　結(jié)論：本文運(yùn)用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，并在手術(shù)前進(jìn)行右美托咪定處理，對(duì)缺血再灌注后大鼠心肌組織損傷、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、膽堿能信號(hào)通路分子等進(jìn)行檢測(cè)和分析，并在臨床樣本資料中加以分析驗(yàn)證。得到以下結(jié)論：
　　1、右美托咪定能