基于免疫應(yīng)激的何首烏特異質(zhì)肝損傷的初步研究.pdf

1、何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，是臨床常用補益中藥，傳統(tǒng)不認為是有毒的中藥。然而，近年來國內(nèi)外有關(guān)何首烏及其制劑肝損傷不良反應(yīng)的報道逐漸增多，英國、加拿大、澳大利亞、我國的藥品監(jiān)管部門相繼出臺何首烏及其制劑肝損傷警示和相關(guān)監(jiān)管政策，引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注。
　　課題組前期臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)何首烏肝損傷病例具有特異質(zhì)肝損傷特征，結(jié)合免疫因素在藥源性特異質(zhì)肝損傷中的重要影響作用，本文首先

2、提出免疫應(yīng)激是何首烏特異質(zhì)肝損傷的重要誘因，進一步采用免疫應(yīng)激模型驗證何首烏特異質(zhì)肝損傷的客觀性，并對免疫應(yīng)激介導的何首烏特異質(zhì)肝損傷相關(guān)細胞因子、物質(zhì)成分、差異基因及生物標志物進行了篩查。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.基于藥物流行病學調(diào)查的何首烏特異質(zhì)肝損傷的客觀性：根據(jù)文獻報道、以及對國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心、解放軍302醫(yī)院藥物性肝損傷病例的回顧性分析，排除易混淆診斷肝病、排除聯(lián)合應(yīng)用具有肝毒性西藥、排除偽品、重金屬/農(nóng)

3、殘/真菌毒素污染等因素，結(jié)合生藥學鑒定最終確認的何首烏肝損傷總體發(fā)病率較低，未見劑量、用藥時間與發(fā)生率的相關(guān)性，推測屬于特異質(zhì)肝損傷。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了何首烏肝損傷臨床樣本中IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子表達顯著上調(diào)，提示免疫因素可能參與了何首烏肝損傷過程；進一步分析發(fā)現(xiàn)，白發(fā)病、濕疹、白癜風、骨關(guān)節(jié)病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等與免疫相關(guān)的基礎(chǔ)性疾病的患者服用何首烏出現(xiàn)肝損傷的幾率相對較高，這些患者往往伴隨IL-1、IL-6

4、、IFN-γ等細胞因子輕度升高，提示具有這些基礎(chǔ)疾病的患者體質(zhì)可能屬于免疫應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)合免疫因素在藥源性特異質(zhì)肝損傷中的重要影響作用，綜上提示免疫應(yīng)激可能是何首烏導致特異質(zhì)肝損傷的重要誘因之一。
　　2.基于免疫應(yīng)激動物模型的何首烏特異質(zhì)肝損傷的客觀性評價：針對免疫應(yīng)激可能是何首烏特異質(zhì)肝損傷誘因的認識，采用國際上廣泛使用的免疫應(yīng)激介導的特異質(zhì)藥物肝損傷動物模型，考察何首烏特異質(zhì)肝損傷的客觀性。結(jié)果表明，在正常大鼠上單次灌胃給藥超

5、大劑量生何首烏50％乙醇提取物（75.6g生藥/kg，相當于臨床常用劑量12g的70倍）也未見明顯肝損傷作用，與文獻報道結(jié)果一致，表明何首烏對正常動物的肝毒性不強；而在內(nèi)毒素（尾靜脈注射LPS2.8mg/kg）制備的免疫應(yīng)激大鼠模型上，何首烏醇提物單次灌胃給藥在1.08～75.6g生藥/kg的范圍內(nèi)均出現(xiàn)顯著的肝功能損傷（均P<0.05），肝臟組織切片可見明顯病理學改變，且表現(xiàn)出一定的量-毒關(guān)系，最低中毒劑量相當于臨床常用劑量12g/日

6、，病理、毒理學特征與文獻報道的藥物特異質(zhì)肝損傷結(jié)果相似。上述研究結(jié)果從實驗證實了免疫應(yīng)激介導的何首烏特異質(zhì)肝損傷的客觀真實性。
　　3.免疫應(yīng)激介導何首烏特異質(zhì)肝損傷的相關(guān)細胞因子篩查：為了進一步探討何首烏特異質(zhì)肝損傷與肝臟免疫應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)系，采用Luminex細胞因子檢測芯片對大鼠肝組織與血漿中細胞因子進行篩查。結(jié)果表明，與正常大鼠比較，免疫應(yīng)激模型大鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等13個炎性細胞因子、趨化因子有不同

7、程度的表達上調(diào)（P<0.05），表明肝臟處于免疫應(yīng)激狀態(tài)，但其表達上調(diào)量尚未達到引起明顯肝損傷的程度；與免疫應(yīng)激模型大鼠比較，聯(lián)合給予何首烏（1.08g生藥/kg）的大鼠肝組織中有8個炎性細胞因子和趨化因子（IL-1、IL-6、TNF-α等）表達顯著上調(diào)（P<0.05），表明肝臟發(fā)生急性炎癥，與前述觀察到的急性肝損傷現(xiàn)象吻合。上述在免疫應(yīng)激模型大鼠篩查到的何首烏特異質(zhì)肝損傷的相關(guān)細胞因子，與前述臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)的多個細胞因子相吻合，綜合提示

8、機體免疫應(yīng)激狀態(tài)可能是何首烏特異質(zhì)肝損傷的重要誘因之一。
　　4.基于免疫應(yīng)激狀態(tài)的何首烏特異質(zhì)肝損傷相關(guān)物質(zhì)研究：采用上述免疫應(yīng)激介導的特異質(zhì)肝損傷評價模型，平行比較了生何首烏總提物（50%乙醇提取物）與不同萃取部位（乙酸乙酯部位、氯仿部位和其它部位）的肝損傷作用。結(jié)果表明，與正常對照組比較，免疫應(yīng)激模型組、正常大鼠灌胃總提物和不同萃取部位組均未見明顯肝損傷（P>0.05）；與免疫應(yīng)激模型組比較，可比劑量（1.08g生藥/kg）

9、的總提物和乙酸乙酯萃取部位均可導致免疫應(yīng)激模型大鼠明顯的肝損傷（P<0.05），且乙酸乙酯萃取部位與總提物導致的肝損傷程度相當，而氯仿萃取部位、其它部位單獨給藥或聯(lián)合給藥（氯仿萃取部位+其它部位）均未導致免疫應(yīng)激模型大鼠明顯的肝損傷（P>0.05），進一步將乙酸乙酯萃取部位加回氯仿萃取部位和其它部位（與總提物相當），肝損傷再次出現(xiàn)。上述結(jié)果綜合提示，乙酸乙酯萃取部位可能是何首烏特異質(zhì)肝損傷作用的主要成分部位。
　　液質(zhì)聯(lián)用儀分析表

10、明，何首烏乙酸乙酯萃取部位主要包括反式二苯乙烯苷、順式二苯乙烯苷、二苯乙烯苷二聚物等成分，順、反二苯乙烯苷在該部位所占比例最高，可能與何首烏特異質(zhì)肝損傷相關(guān)。為此，在免疫應(yīng)激模型大鼠上對比考察了順、反二苯乙烯苷的毒性差異。結(jié)果表明，與正常對照組比較，免疫應(yīng)激模型組、正常大鼠灌胃順、反二苯乙烯苷組均未見明顯肝損傷（P>0.05）；與免疫應(yīng)激模型組比較，反式二苯乙烯苷無明顯肝損傷作用（P>0.05），順式二苯乙烯苷可導致免疫應(yīng)激模型大鼠明顯

11、的肝損傷（P<0.05）。此外，在正常人肝細胞（L02）上，相同濃度（2mg/mL、1.33mg/mL、0.89mg/mL、0.59mg/mL、0.395mg/mL、0.263mg/mL）下順式二苯乙烯苷的細胞毒性大于反式二苯乙烯苷。上述結(jié)果綜合提示，順式二苯乙烯苷的毒性大于反式二苯乙烯苷。由于一般情況下順式二苯乙烯苷在何首烏藥材中含量很少，主要是由反式二苯乙烯苷在溶液中經(jīng)光照轉(zhuǎn)化而成，提示何首烏在進行泡酒或藥液保存過程中應(yīng)避光保存，避

12、免或減少順式二苯乙烯苷的生成，降低臨床應(yīng)用發(fā)生特異質(zhì)肝損傷的風險。
　　5.何首烏特異質(zhì)肝損傷相關(guān)的基因和代謝標志物研究：針對順、反二苯乙烯苷對免疫應(yīng)激模型大鼠肝損傷差異，采用基因芯片和代謝組學方法對何首烏特異質(zhì)肝損傷的相關(guān)差異基因和代謝標志物進行初步研究。
　　針對上述灌胃給予順、反二苯乙烯苷的免疫應(yīng)激模型大鼠肝組織，利用基因芯片篩選差異表達基因。結(jié)果表明，與反式二苯乙烯苷組相比，順式二苯乙烯苷組有57條基因表達量顯著上調(diào)

13、，126條基因顯著下調(diào)；利用KEGG數(shù)據(jù)庫對信號通路進行了分析，順、反二苯乙烯苷間的差異表達基因富集到PPAR signaling pathway、TGF-beta signaling pathway和Tryptophan metabolism等14條生物學通路，其中PPAR-γ信號通路相關(guān)性最強（顯著下調(diào)，P值為1.72E-06），PPAR-γ信號通路基因下調(diào)可解除其對LPS誘導的NF-κB靶基因的抑制作用，表明TLR4-NF-κB通

14、路可能是順式二苯乙烯苷導致特異質(zhì)肝損傷的重要基因通路，該結(jié)果與上述免疫應(yīng)激介導的細胞因子篩選結(jié)果一致，綜合提示免疫應(yīng)激可能是順式二苯乙烯苷特異質(zhì)肝損傷的重要機制。
　　利用代謝組學方法篩選與何首烏中順式二苯乙烯苷特異質(zhì)肝損傷相關(guān)的代謝標志物。采用UHPLC-Q-TOF/MS測定順、反二苯乙烯苷聯(lián)合LPS后大鼠血清中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，研究與肝損傷密切相關(guān)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化特征。結(jié)果顯示，順式二苯乙烯苷聯(lián)合 LPS后大鼠血清與正常

15、大鼠、LPS模型大鼠、反式二苯乙烯苷聯(lián)合LPS后大鼠血清的代謝輪廓差異顯著；篩選出順式二苯乙烯苷特異質(zhì)肝損傷引發(fā)代謝紊亂的Bovinocidin、Uridine、D-Ornithine等9個特征標志物。通過KEGG數(shù)據(jù)庫通路分析，篩選出 Pyrimidine metabolism、D-Arginine and D-ornithine metabolism、Ascorbate and aldarate metabolism等5條代謝通路與