GSK3β過表達對阿姆西汀、小補心湯總黃酮抗抑郁作用的影響.pdf

1、目的:
　　軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所神經(jīng)精神藥理研究室長期從事抗抑郁藥物研發(fā)及相關基礎研究。前期以度洛西汀(duloxetine，DLX)為先導化合物，合成篩選出新型化合物鹽酸阿姆西汀(ammoxetine，AMX)，前期已經(jīng)證實其具有顯著的抗抑郁活性，并且肝毒性遠遠低于度洛西汀。小補心湯(XBXT)屬于傳統(tǒng)古方中藥，最早見于南北朝時期的敦煌莫高窟遺書《輔行決臟腑用藥法要》，由代赭石、旋復花、竹葉、淡豆豉四味中藥組成。該研究室

2、首次發(fā)現(xiàn)XBXT及其總黃酮提取物(XBXT-2)在多種模型上表現(xiàn)出明確的抗抑郁活性。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)及其相關信號通路與抑郁癥的發(fā)生和治療密切相關，GSK3β失活（磷酸化增加）會產(chǎn)生抗抑郁作用，本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)AMX和XBXT-2均可以增加GSK3β磷酸化水平并激活其相關信號通路。本研究擬在前期工作的基礎上，采用基因轉染技術，使小鼠腦組織海馬

3、部位GSK3β過表達或者持續(xù)激活，進一步探究AMX和XBXT-2對GSK3β相關信號通路的影響，試圖闡明GSK3β及其相關信號通路是否是AMX和XBXT-2抗抑郁作用發(fā)揮的關鍵環(huán)節(jié)。
　　方法:
　　本研究采用以腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)為載體的基因轉染技術，構建包裝有GSK3β(WT)野生型和GSK3β(S9A)突變型基因的腺相關病毒，通過海馬立體定位微注射的方式，使GSK3β在小鼠

4、海馬過表達或者持續(xù)激活，通過一系列行為學和分子生物學實驗探討GSK3β是否是AMX、XBXT-2發(fā)揮抗抑郁、抗焦慮作用的關鍵分子靶標。
　?。ㄒ唬┖ｑRGSK3β過表達/持續(xù)激活對AMX抗抑郁作用的影響:
　　進行小鼠海馬腦區(qū)微注射，使GSK3β在海馬過表達/持續(xù)激活，通過懸尾實驗和強迫游泳實驗，研究海馬GSK3β過表達/持續(xù)激活對阿姆西汀抗抑郁作用的影響;并通過蛋白免疫印跡法(western blot)檢測海馬腦區(qū)PI-3K

5、/Akt/GSK3β信號通路的功能蛋白及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)含量的變化。
　?。ǘ┖ｑRGSK3β持續(xù)激活對XBXT-2抗抑郁作用的影響:
　　進行小鼠海馬腦區(qū)微注射，使GSK3β在海馬持續(xù)激活，通過懸尾實驗、強迫游泳實驗、高架十字迷宮實驗、爬梯實驗研究海馬GSK3β持續(xù)激活對小補心湯總黃酮抗抑郁、抗焦慮作用的影響;進行小鼠海馬腦區(qū)微注射，使GSK3β在海馬持續(xù)激活，在獲得性無助模型上探究GSK3β的失抑制是否會增

6、加抑郁的易感性;并通過western bolt方法檢測PI-3K/Akt/GSK3β信號通路各蛋白以及BDNF含量的變化，探討GSK3β失抑制增加抑郁易感性的機制。
　　結果:
　　（一）AMX單次給藥(2.5mg/kg)可以顯著縮短陰性病毒組小鼠的懸尾不動時間，該行為效應能夠被小鼠海馬GSK3β過表達/持續(xù)激活所取消;AMX單次給藥(5 mg/kg)可以顯著縮短陰性病毒組小鼠的強迫游泳不動時間，該行為效應能夠被小鼠海馬GS

7、K3β過表達/持續(xù)激活所取消;無論是藥物還是海馬GSK3β過表達/持續(xù)激活均對小鼠自發(fā)活動沒有影響;western blot結果顯示AMX可以上調(diào)p-Akt、p-GSK3β、p-CREB、BDNF的蛋白表達水平，但是該作用被GSK3β過表達/持續(xù)激活所取消。
　?。ǘBXT-2長期給藥(100mg/kg)可以顯著縮短陰性病毒組小鼠的懸尾不動時間和強迫游泳不動時間，該行為效應均能夠被海馬GSK3β持續(xù)激活所取消;XBXT-2長期

8、給藥（100mg/kg），可以顯著縮短陰性病毒組小鼠在爬梯實驗中的站立次數(shù)，該行為效應能夠被海馬GSK3β持續(xù)激活取消;XBXT-2長期給藥(100mg/kg)，可以顯著增加陰性病毒組小鼠在高架實驗中進入開臂次數(shù)的百分比和在開臂停留時間的百分比，該行為效應不僅被海馬GSK3β持續(xù)激活所取消，并且海馬GSK3β持續(xù)激活顯著降低了小鼠進入開臂次數(shù)的百分比;在獲得性無助模型中，GSK3β持續(xù)激活小鼠逃避失敗次數(shù)顯著增加，糖水偏嗜度顯著下降，并

9、且XBXT-2的抗抑郁行為效應被完全取消;western blot結果顯示在獲得性無助造模之后，GSK3β持續(xù)激活小鼠的p-Akt、p-GSK3β、p-CREB、BDNF表達水平同陰性病毒組相比均顯著下降，并且XBXT-2對這些蛋白的上調(diào)作用亦被完全取消。
　　結論:
　　通過本課題實驗研究可得到如下結論:(1)在懸尾實驗和強迫游泳實驗中，海馬GSK3β過表達或持續(xù)激活不能引起小鼠抑郁樣表現(xiàn)，但是能夠取消AMX和XBXT-2

10、的抗抑郁行為效應;(2)在高架十字迷宮實驗和爬梯實驗上，GSK3β持續(xù)激活取消了XBXT-2的抗焦慮作用，并且在高架十字迷宮實驗中產(chǎn)生致焦慮樣行為表現(xiàn);(3)在獲得性無助模型中，GSK3β持續(xù)激活會導致應激易感性增加;(4) GSK3β過表達/持續(xù)激活對p-Akt、p-CREB和BDNF的蛋白表達水平無顯著影響，但是能夠取消AMX對這些蛋白含量的上調(diào)作用;(5) GSK3β持續(xù)激活在獲得性無助模型之后，能夠顯著下調(diào)p-Akt、p-CRE