Akt家族在肝肺綜合征大鼠血清誘導(dǎo)PMVECs增殖中的表達研究-.pdf

1、背景與目的：
　　 肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎(chǔ)上出現(xiàn)肺內(nèi)微血管異常擴張、氣體交換障礙、動脈血氧合作用異常而導(dǎo)致的一種綜合病征，在肝硬化患者中發(fā)病率可達15％，也是引起移植圍術(shù)期移植肝無功能及肺部感染的主要原因。盡管HPS的研究逐漸成為研究熱點，但其發(fā)生發(fā)展機制仍不明確，Sindhu等認為以肺內(nèi)分流為主的血液分流是HPS的主要病因，其中肺內(nèi)微血管擴張是肺內(nèi)

2、功能性分流的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。通過增強-對比超聲檢查、99m锝-多聚蛋白肺灌注顯像、肺血管造影等方法均可證實HPS患者肺內(nèi)血管床在前毛細血管和毛細血管水平存在廣泛擴張，即發(fā)生顯著性的肺微血管擴張(Pulmonary vaso dilatation，PVD)。由于肺微血管主要構(gòu)成細胞為肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)，因此顯著性肺微血管擴張(擴張直徑可達20-5

3、0μm)只能由PMVECs異常增殖完成。由此，目前絕大多數(shù)學(xué)者認為PMVECs異常增殖致使微血管擴張，擴張的微血管導(dǎo)致血紅蛋白氧合困難產(chǎn)生難治性低氧血癥和低氧肺血管重建(肺平滑肌細胞的異常增殖導(dǎo)致肺動脈壁增厚)而進一步加重低氧血癥，從而導(dǎo)致HPS的發(fā)生和進展。雖然HPS微血管擴張的機制尚不明確，但比較一致的意見認為：眾多的肝源性細胞因子通過血液循環(huán)作用于PMVECs后都促使其發(fā)生了增殖反應(yīng)。由于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt(serine

4、/threonine kinase，Akt)處于多條信號通路的重要交叉點，可調(diào)節(jié)細胞因子、生長因子等細胞生存信號，普遍存在于真核生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，與多種增生增殖疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制Akt相關(guān)通路后，對其他信號通路引發(fā)的細胞增殖現(xiàn)象有一定的抑制作用。基于以上理由，我們推測在慢性肝病和/或門脈高壓的基礎(chǔ)上，血清中眾多的肝源性細胞因子作用于Akt家族，使PMVECs異常增殖，進而發(fā)生顯著性的肺微血管擴張，導(dǎo)致HPS的發(fā)生發(fā)展

5、，這正是本研究立題的目的所在。本研究采用建立HPS大鼠模型、培養(yǎng)PMVECs、MTT、3H-TdR摻入實驗、聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chin Reaction，PCR)、蛋白印記(Western Blot)等技術(shù)和方法，通過HPS大鼠血清培養(yǎng)PMVECs，檢測PMVECs增殖情況、Akt家族(Akt1，Akt2，Akt3)的表達水平變化，探討HPS發(fā)生的原因和可能機制。
　　 方法：
　　 實驗分三部分：<

6、br>　　 1.建立HPS大鼠模型，提取血清
　　 采用的慢性膽管結(jié)扎法制備HPS大鼠模型，并鑒定。提取血清。
　　 2.PMVECs的培養(yǎng)以及增殖檢測
　　 取正常大鼠，原代培養(yǎng)、純化及鑒定PMVECs。PMVECs隨機分為2組：對照組(C組)和HPS干預(yù)組(HPS組)，孵育24、48和72 h(T1～3)，采用MTT法和3H-TdR摻入法檢測PMVECs增殖能力。
　　 3.Akt家族的mRNA以及

7、蛋白表達的檢測
　　 兩組PMVECs孵育24、48和72 h后采用RT-PCR法和Western blot法分別檢測Akt1 mRNA、Akt2 mRNA和Akt3 mRNA及其蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.HPS大鼠血清對PMVECs增殖的影響
　　 與C組比較，HPS組PMVECs增殖能力增強(P<0.05)；HPS組中，隨著培養(yǎng)時間的增加，PMVECs增殖能力增加，與T1時比較，T2，T3

8、時HPS組PMVECs增殖能力增強(P<0.05)，與T2時比較，T3時HPS組PMVECs增殖能力增強(P<0.05)。
　　 2.Akt家族的mRNA表達的檢測
　　 采用RT-PCR法檢測Akt1 mRNA、Akt2 mRNA和Akt3 mRNA，結(jié)果顯示：與C組比較，HPS組PMVECs Akt mRNA表達水平升高(P<0.05)；HPS組中，隨著培養(yǎng)時間的增加，PMVECs Akt mRNA表達增強，與T1時

9、比較，T2，T3時HPS組PMVECsAkt mRNA表達水平升高(P<0.05)，與T2時比較，T3時HPS組PMVECs Akt mRNA表達增強(P<0.05)。
　　 3.Akt家族的蛋白表達的檢測
　　 采用RT-PCR法檢測Akt1蛋白、Akt2蛋白和Akt3蛋白，結(jié)果顯示：與C組比較，HPS組PMVECs Akt蛋白表達增強(P<0.05)；HPS組中，隨著培養(yǎng)時間的增加，PMVECs Akt蛋白表達增強，

10、與T1時比較，T2，T3時HPS組PMVECs Akt蛋白表達增強(P<0.05)，與T2時比較，T3時HPS組PMVECs Akt蛋白表達增強(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在HPS大鼠血清誘導(dǎo)下，PMVECs增殖能力增強，提示HPS大鼠血清可通過某種途徑導(dǎo)致HPS發(fā)生發(fā)展過程中PMVECs的增殖。
　　 2.隨著時間的延長，HPS大鼠血清誘導(dǎo)的PMVECs中Akt家族蛋白及其mRNA表達增強，表明